海洋石油降解菌群的固定化及石油降解特性*

高祥興 高 偉 崔志松 李馨子 李 倩韓 彬 周 濤 鄭 立①

(1. 國家海洋局第一海洋研究所海洋生態研究中心 青島 266061; 2. 青島科技大學化工學院 青島 266000)

近年來由于各種自然或人為原因,海洋溢油事故頻發。溢油污染大大超出并嚴重破壞了海洋生態環境的自凈能力,從而直接或間接對人們的生產和生活產生影響(徐衛東等,1999; 陳堯,2003)。尋求環境友好且低成本的溢油清除策略是當前海洋環境治理急需解決的問題。目前,已有眾多用于緩解和治理原油污染的方法(Obuekweet al,2001)。其中傳統的物理化學方法能夠快速地消除溢油,但實際應用中往往只在溢油初期發揮較好的效果,且成本較高,并能造成二次污染(Obuekweet al,2001)。此外,有研究表明(Daveet al,2006; Xiaet al,2010),1989年美國阿拉斯加溢油產生的殘存油污在20年后仍沉積于初始溢油岸灘區域,因而物理化學方法并不能完全清除溢油污染。

溢油生物修復方法是利用石油降解微生物的礦化作用使原油轉化為CO2、H2O和自身生物量(R?linget al,2004; Chandranet al,2011) 來清除污染海域的石油污物,與其它修復方式相比具有清潔、高效和低廉的優點(Ojo,2006),已成為最具發展潛力的溢油處理策略(Vogel,1996; Janssonet al,2000; Cunninghamet al,2004)。然而,在實際生物修復應用中,很多問題需要克服解決,如添加微生物活性的維系(Mishraet al,2001)、開放海域的沖刷稀釋(Taggeret al,1983;Macnaughtonet al,1999)及土著微生物較弱的溢油生物修復能力等。面對以上問題,越來越多學者認為,微生物固定化技術是最好的解決途徑。與施加游離微生物相比,微生物固定化技術具有以下優勢: (1) 因降解微生物高密度聚集,降解率提高; (2) 生物降解穩定性及對各種稀釋、捕食復雜環境的耐受性增強;(3) 刺激微生物的生長繁殖及重復利用(Van Veenet al,1997; Wanget al,1997; Wanget al,2012)。

目前,利用固定化細菌進行降解多種污染物的研究已取得一定進展,并獲得較好效果(Lianget al,2009; Tanet al,2014)。就固定化載體而言,應具有制備簡易、易獲得、低廉、物理性能可靠(Elliottet al,2007)(能抵御環境壓迫和支撐起足夠的微生物空間)等特點,如海藻酸鈉、聚乙烯醇(PVA)(段曉琛等,2013;Surkattiet al,2014)、棉花纖維、殼聚糖等(Gentiliet al,2006; Houet al,2013; Linet al,2014)。其中PVA因機械強度高、無毒等特性被認為是酶及微生物的有效包埋載體之一(Wanget al,2006),同時PVA亦具有一定的生物降解特性(Suzukiet al,1973; 王銀善等,1991;Matsumuraet al,1999; Chiellini,2003; 董麗娟等,2005)。此外,海藻酸鈉作為固定化載體和菌體保護劑(鄭立等,2012)同樣受到關注。考慮到實際溢油生物修復過程的復雜性(微生物的環境兼容性、菌體活性維系等),本研究以實驗室自主構建并獲得國家發明專利保護(ZL201010223463.6)的海洋石油專性解烴菌群DC10作為目標菌株,利用高機械性能的PVA作為主要包埋載體,構建固定化微球骨架,輔以海藻酸鈉和活性炭作為菌體保護劑和細菌固定化微球網絡疏松劑,進行固定化研究。通過考察細菌固定化微球物理化學性能確定固定化材料最佳濃度配比,為之后開展海洋溢油生物修復工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 降解菌群及培養基 本文所涉及的降解菌群DC10包括2種(3株)海洋專性解烴菌,其中1株菌(PY97S)屬于海桿菌(Marinobactersp.),2株菌(97CO-6和97CO-5)屬于食烷菌(Alcanivoraxsp.)。上述3株菌已保藏至中國普通微生物菌種保藏中心,保藏號分別為CGMCC No.3735、CGMCC No.3736和CGMCC No.3244;

M8培養基(Cuiet al,2008): 用于菌種活化及擴大培養;

ONR7a培養基(Dyksterhouseet al,1995): 模擬海水,用于石油培養基配制及細菌固定化微球機械性能測試;

石油培養基: 100mL ONR7a中添加1g原油(1%)。

1.1.2 主要儀器 氣相色譜質譜儀(GC/MS):6890N-5973N型,Agilent公司; 大容量高速冷凍離心機: CR22GⅡ型,日本日立公司; 蠕動泵: BT00-300M型,保定蘭格恒流泵公司; 懸臂式攪拌器:RW20DZM.n型,德國 IKA公司; 恒溫培養搖床:THZ-100型,上海一恒科學儀器公司; 電子天平:BSA224S-CW,Sartorius公司; 掃描電鏡: Hitachi S-4800場發射掃描電鏡,日本株式會社日立制作所。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌群培養及構建 取–80°C 甘油管藏的上述三種菌株分別于 M8培養基中活化并擴大培養至OD630≈1.2 [(1.2—2.3)×109CFU/mL]; 分別通過高速離心(7500r/min,8min)獲得菌體,無菌海水洗滌三次,按 1∶10 (W/V)比例無菌海水重懸; 將三種菌懸液按1∶1∶1比例(體積比)均勻混合構建石油降解菌群DC10,4°C保存待用。

1.2.2 細菌固定化微球制備材料組成研究 采用蠕動泵滴落法(曹暉等,1997),將不同濃度PVA和海藻酸鈉及活性炭按正交實驗設計表(表1)置于250mL三角瓶內,滅菌(121°C 15min)處理; 80°C 恒溫水浴中無菌海水溶解,后冷卻至 40°C將上述所構建菌群懸液與載體凝膠按照(V/V) 1: 10的比例均勻混合,經蠕動泵滴入飽和硼酸和 4% CaCl2的混合溶液(交聯劑)中,懸臂式攪拌器(轉速 100r/min)攪拌,交聯 24 h,分離凝膠小球,無菌海水洗滌3次后4°C保存待用。

表1 細菌固定化微球制備正交試驗設計Tab.1 The orthogonal design for the production of immobilized bacterial microspheres

1.2.3 細菌固定化微球微觀結構觀察 隨機挑取2—3個細菌固定化微球,用戊二醛對其進行固定處理,PBS緩沖液洗滌,乙醇梯度脫水; 二氧化碳臨界點干燥,離子濺鍍金,Hitachi S-4800場發射掃描電鏡觀察(李馨子等,2014)。

1.2.4 細菌固定化微球物理性能評價 機械強度:取2g上述4°C保存的細菌固定化微球放入含有等量沙石的50mL無菌海水中,28°C,125r/min搖床振蕩,12d后記錄破碎顆數并按公式(1)計算破碎率(毛書端等,2012),同時測定重量變化,按照公式(2)計算固定化微球磨損率,每種處理設3個平行。

式中,d1為實驗初始時細菌固定化微球數,d2為實驗結束時細菌固定化微球數;n1為實驗初始時細菌固定化微球重量,n2為實驗結束時細菌固定化微球重量。

傳質性能: 挑選 2g上述 4°C保存的細菌固定化微球放入 30mL含 2滴藍黑墨水的無菌水中,28°C,125r/min搖床振蕩,每種處理設3個平行。測定溶液A406以間接表示固定化微球的傳質性能。傳質性能與溶液406nm吸光度呈反比(康春莉等,2007)。

粒徑: 隨機選取制備好的細菌固定化微球(n＞20)緊密排成一排,游標卡尺測量微球總直徑,重復3次,求其平均值作為每粒粒徑,同時觀察和記錄固定化小球的外觀特點。

菌含量: 于超凈工作臺內隨機挑選 30粒(≈1.7g)細菌固定化微球,無菌海水洗滌 2—3次,后用無菌鑷子扯碎并用 6mL無菌海水浸泡,窩旋震蕩使菌體充分析出。然后通過10倍梯度稀釋平板計測菌體含量,每種處理設3個平行(Queket al,2006)。

石油吸附性能測試: 取10g無菌固定化微球放入1.1.1所述的石油培養基內,以未添加固定化微球和菌液的石油培養基為陰性對照,28°C,125r/min搖床振蕩12d,后按照1.2.5所述方法測定固定化微球石油吸附性能,每種處理設3個平行。

1.2.5 細菌固定化微球石油降解性能分析 通過上述細菌固定化微球物理性能評價,選取最適組合進行石油降解性能測試。取10g細菌固定化微球進行石油降解分析,以添加含等量菌體的菌液為陽性對照,以未添加細菌固定化微球和菌液的石油培養基為陰性對照,條件為28°C,125r/min,12d; 觀察石油乳化和降解情況,上述每種處理設 3個平行。此外,為檢測細菌固定化微球可持續性利用效果,在實驗結束后收集細菌固定化微球并再次進行上述相同的降解實驗(Pannieret al,2010)。

樣品處理、石油降解率測定、石油烴分析方法如下: 降解12d后,離心(8000r/min,10min)除去固定化微球和菌體,50mL CH2Cl2分三次洗滌三角瓶并倒入分液漏斗內萃取其中的殘余油污。取 20 mL CH2Cl2相萃取液轉移到尖底燒瓶中,40°C減壓濃縮,氮氣吹干,按照公式(3)計算降解率。

式中,m0為最初加入培養基中的石油重量;m1為對照組萃取后殘留油污重量;m2為固定化微球石油吸附后殘留油污重量;m3為固定化菌劑石油降解后殘留油污重量;T為石油自然風化量(A)或石油微球吸附量(B)或石油降解量(C)。另從CH2Cl2相準確量取2mL溶液,用無水Na2SO4脫水,過0.22μm耐有機溶劑濾膜。氮氣吹干,以1mL正己烷重新溶解,加入內標氘代三聯苯和5α-雄甾烷,用GC-FID,GC-MS對石油降解后殘留的烷烴、芳香烴組分進行分析測定(鄭立等,2012)。

2 結果與分析

2.1 細菌固定化微球物理性能測試

按照既定的方案制備各組細菌固定化微球,實驗中發現組 S1、S4無法成球,在交聯劑表面形成漂浮的泛白水膜,而組 S7雖然有部分下沉但仍然漂浮于交聯劑表面,呈 T形且拖尾嚴重。除組 S1、S4、S7外,其它各組均可以成球。

實驗結果表明細菌固定化微球機械性能受 PVA濃度的影響(圖1)。低濃度PVA細菌固定化微球的機械性能較差,例如組 S2、S3細菌固定化微球磨損率和破碎率達 50%以上,不適于海浪沖刷的岸灘環境;當 PVA濃度為 40—60g/L時滿足以最少的耗材獲得相對較佳的固定化效果,例如組 S5、S6細菌固定化微球磨損率在10%左右,而組S8、S9細菌固定化微球磨損率僅5%左右,具有較好的機械性能。此外,實驗發現,在 PVA-海藻酸鈉-硼酸-CaCl2交聯制備細菌固定化微球過程中,只有微球完全浸沒于交聯劑,且進行適度攪拌,才可避免細菌固定化微球接觸凝聚成團,獲得圓整的細菌固定化微球。

圖1 細菌固定化微球機械性能Fig.1 Mechanical properties of immobilized bacterial microspheres Sn: 試樣分組

研究發現(表 2)各細菌固定化微球的粒徑均在5mm左右,且隨PVA濃度增大,粒徑變化不大,但微球的傳質性能和所固定的菌體含量差別較大。其原因可能是在給定蠕動泵流速下,PVA含量增高,固定化微球內部網絡交聯致密,致使空間減小,因而菌體含量降低、傳質阻力增大。因此制備固定化微球時,在滿足機械性能和成球性條件下,可采用較低的PVA、海藻酸鈉及活性炭濃度。

表2 細菌固定化微球特征參數Tab.2 Characteristic parameters of immobilized bacterial microspheres

2.2 細菌固定化微球石油降解性能分析

通過綜合分析細菌固定化微球各物理性能參數,實驗選取最適材料組合S5、S6和S8進行石油降解菌群DC10固定化,研究其石油降解特性。

2.2.1 固定化菌群DC10的石油降解率 經過12d的降解實驗,通過重量法測定各組石油降解率和固定化顆粒石油吸附性能。固定化微球石油吸附性能測試發現,石油培養基內固定化微球沉于液體底部,而石油浮于表層,微球表面僅少許油滴。經重量法測定,與陰性石油培養基(7.9%)相比,固定化微球石油吸附率4.5%,差異不顯著。而菌群DC10固定化微球石油降解率均在25%以上,且優于游離菌體(FB)(圖2)。其中組S8相對于組S5和S6更具優勢,石油降解率提高近 7%。這說明微生物固定化技術可減弱外界復雜環境對菌體的干擾,保持其較高活性,且使得石油降解能力明顯提高(P＜0.05)。

2.2.2 固定化菌群 DC10石油烴降解特性分析通過 GC-MS分析各組石油烴降解狀況,結果顯示游離菌群和各細菌固定化微球對石油烷烴芳烴都具有較好的降解效果,降解率在30%—45%之間。值得注意的是,相對于游離菌群,固定化菌群 DC10對烷烴和芳烴具有更好的分解能力,其中 S8微球石油烴降解率分別提高了7%和8% (圖3a和圖3b)。

圖2 細菌固定化微球石油降解率Fig.2 Percentage of oil degradation by immobilized bacterial microspheresSn: 試樣分組; FB: 游離菌液; OA: 石油吸附性能; NC: 未添加細菌的自然風化; 柱形圖上方不同字母之間表示差異顯著P＜0.05

圖3 細菌固定化微球石油烴降解率Fig.3 Percentage of biodegradation on oil hydrocarbons by immobilized bacterial microspheres a. 石油烷烴(C16-C32)降解率; b. 石油多環芳烴降解率

從烷烴組分來看(圖 4),游離菌群和各固定化微球對 C16—C32的烷烴具有很好的降解效果,C16、C17、C24、C27降解效果達到了50%。就烷烴而言,固定化菌群DC10的降解特性沒有發生變化,但是對高分子量烷烴的降解能力增強。特別是對 C19、C22、C25—C32的分解能力。從芳烴降解情況來看(圖 5),降解規律與烷烴基本一致,游離菌群DC10和固定化微球對石油中大部分芳烴(萘、芴、菲、誳)具有良好的生物降解能力,其中組 S8優勢更為顯著。這說明微生物經過固定化處理后其生物活性得到提升。

圖4 石油降解后烷烴含量Fig.4 Post-biodegradation alkane concentrations by immobilized bacterial microspheresn-Cm: m碳正構烷烴,如n-C16為十六碳正構烷烴; Sn: 表示試樣分組; FB: 表示游離菌液; NC: 表示未添加細菌的自然風化

圖5 石油降解后芳烴含量Fig.5 The post-biodegradation concentrations of PAHs by immobilized bacterial microspheresC0-N、C0-F、C0-D、C0-P 分別為萘、芴、二苯并噻吩、菲、誳 ; C1(C2,C3,C4)-萘表示在碳原子上修飾有1(2,3,4)個烷基; C1(C2,C3)-芴表示在碳原子上修飾有1(2,3)個烷基; C1(C2,C3)- 二苯并噻吩表示在碳原子上修飾有1(2,3)烷基; C1(C2,C3,C4)-菲表示在碳原子上修飾有1(2,3,4)個烷基; C1(2) 誳表示在碳原子上修飾有1(2)個烷基) (Sn: 表示試樣分組; FB: 表示游離菌液; NC: 未添加細菌的自然風化)

2.2.3 細菌固定化微球重復利用性分析 為考察細菌固定化微球的二次利用性能,按照 1.2.5中所述石油降解分析方法將細菌固定化微球回收后再次進行 12d石油降解實驗,發現石油降解率依然保持在20%左右(圖 6),相對于首次降解石油降解率有所下降,這可能是在降解過程中有部分菌體溢出,菌體活性受到影響。但仍有部分菌體很好地固定在微球內部網絡結構空間中,并在較長時間內保持了對石油的降解活性。

圖6 細菌固定化微球二次石油降解效果Fig.6 Percentage post-biodegradation on oil by immobilized bacterial microspheres that recycledSn: 表示試樣分組; NC: 表示未添加細菌的自然風化

2.3 細菌固定化微球電鏡形態觀察

通過物理性能和石油降解性能分析,選取 S8組細菌固定化微球經過相應處理于掃描電鏡下觀察(圖7a和b),發現微球內部凹凸有致,孔洞密集,呈蜂窩狀相互連接,為菌體提供較大的寄居空間; 在具體結構方面,PVA構成微球的主力骨架,活性炭和海藻酸鈉起分散疏松內部網絡的輔助作用,菌體則吸附于微球的網絡骨架中,形態完好,分布均勻。此外,石油降解 12d后的固定化微球于掃描電鏡下觀察發現細菌具有分裂增殖現象(圖6c),說明細菌經過固定化包埋處理后不僅可以得到一定的保護,還可以在固定化網絡空間中生長繁殖,從而可以保持細菌的生物活性并有利于提高對石油的降解能力。

3 討論

本文以聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉為主要材料對海洋石油降解菌群進行固定化研究,以期獲得菌群固定化制劑所需最佳材料濃度及制備流程,并為實際應用作準備。研究發現海藻酸鈉和 PVA濃度在固定化過程中起關鍵作用,實驗選擇合適配比的復合材料,既解決了 PVA的粘連性又解決了海藻酸鈉的脆弱性問題(Longetal,2004)。有文獻(Wangetal,2006; 賴子尼等,2008; 茆云漢等,2013)報道,利用4%—12%濃度的PVA對細菌具有較好的固定化效果且傳輸性能良好。PVA濃度過高,固定化微球制備操作困難,交聯時間延長,從而對微球內部菌體活性造成損傷(Kostkaetal,2011); PVA濃度過低則會因PVA凝膠在同質溶液內弱小的分子間作用力無法抵抗凝膠的自由流動,導致固定化微球內部交聯聚合程度降低,機械性能減弱,同時成球性較差(Wanget al,2006)。此外,研究發現低濃度海藻酸鈉(＜2%)無法促進固定化顆粒的形成(組S1、S4和S7凝膠無法成球),原因可能是海藻酸鈉在 PVA-海藻酸鈉微球構建過程中,早于 PVA 迅速絡合 Ca2+形成微網絡,進而減弱PVA凝膠的自由流動和減小凝膠分子間的距離,促進固定化微球的形成。Kobayashi等(1998)通過反復凍融降低分子間距離,促進分子內部氫鍵的形成的方式獲得固定化微球。SEM 掃描圖片(圖 7b)顯示海藻酸鈉以網絡形式很好地分散于 PVA骨架之間,從而證實以上分析。Pang等(2011)利用 PVA對Pseudomonas aeruginosa固定化吸附重金屬 Cr的研究表明,選取6%濃度PVA進行固定化研究可獲得較好的效果,這與本研究結果相一致。同時研究發現輔以適度攪拌(懸臂式攪拌器100r/min)可解決固定化微球制備交聯成團的問題。

海浪沖刷和稀釋是海洋溢油生物修復過程中面臨的主要問題。已有利用固定化微生物去除環境中污染物的報道(Cunninghametal,2004; Nu?aletal,2014)并取得良好的生態修復效果。Xu等(2010)利用土著石油降解菌群以花生殼為固定化載體修復被石油污染的土壤,固定化體系修復效果(61%)顯著好于游離菌體(27%)。Díaz等(2002)以聚丙烯纖維為載體固定化極耐鹽菌群 MPD-M,發現隨著鹽度增高(0—180g/L)其生物降解效率提高。本研究發現固定化菌體系統較游離菌體亦具有明顯的石油降解效果(P＜0.05),并且降解特性沒有變化,總烷烴和芳烴降解率均在 50%左右,與相關研究結果一致。胡曉亮等(2011)發現細菌可以利用海藻酸鈉作為生長的唯一碳源,因而研究中添加的部分海藻酸鈉可以在一定程度上促進固定化微球內部菌體的繁殖(李馨子等,2014),從而使得固定化菌劑具有優于游離菌液的石油降解效果。另一方面 Kim 等(2006)發現細胞經固定化后細胞膜發生變化,增強了對環境的耐抗性,從而可以抵抗石油分解過程中產生的對微生物代謝具有抑制作用的化合物(環烷酸等)(Luet al,2010)。本研究中固定化菌劑系統為菌體提供了良好的儲存空間和保護環境,降低外部環境變化對菌體造成的影響。同時固定化菌劑石油降解后掃描電鏡觀察發現細菌可以在固定化網絡結構中生長繁殖,可見研究獲得的 PVA固定化細菌體系對包埋其中的細菌具有一定的濃度和生物活性維系作用 (Longet al,2004),以此減輕海水的沖刷及稀釋,從而發揮石油降解菌群的長期修復作用。有研究(鄭立等,2012; 崔志松等,2013)表明菌群DC10在海上突發溢油事故或者海洋原油污染區域的清油治理中取得較好效果,但菌體受海浪沖刷難以定植且菌體活性受到不利生境的影響,因此菌群DC10固定化微球可望為解決這個問題提供思路與方法。

圖7 固定化微球掃描電鏡圖析Fig.7 Scanning electron micrograph of the bacterial immobilized microspheresa. 橫截面結構; b. 內部結構; (1: 固定化的菌體,2: PVA骨架,3: 海藻酸鈉和活性炭); c. 石油降解后固定化微球內部結構

利用固定化海洋石油降解菌群進行溢油生物修復的研究尚處于初級階段,在以下幾方面仍需加強研究,以發展實用的海洋溢油生物修復技術: (1) 細菌固定化微球的常規保存方式,使固定化菌劑能夠長期保存,可用于溢油的應急處置; (2) 細菌固定化微球實際溢油修復的施用方法,如通過將固定化菌劑填于網袋、圍欄條帶等物理方式固定于受污染岸灘區域從而發揮長期修復作用; (3) 細菌固定化微球的環境耐受性(溫度、鹽度、寡營養等因素)及對環境響應情況(微球內部菌群和環境生境變化等)的評估等。

4 結論

本文通過包埋方式將具有良好石油降解性能的海洋石油降解菌群 DC10進行固定化研究,確定了DC10固定化微球制備過程中PVA和海藻酸鈉及活性炭作為載體的最優濃度。研究表明,以6% PVA,2%海藻酸鈉及 0.5%活性炭作為載體可以較快捷地制備細菌固定化微球,微球具有較好的機械性能、傳質性能。石油降解性能分析表明固定化DC10菌群后,固定化菌劑相對于游離菌體(FB)不僅能提高石油降解率,并且具備連續石油降解能力,該技術展現出較高的岸灘石油污染生物修復應用潛力。

王銀善,龐學軍,方慈祺等,1991. 共生細菌 SB1降解聚乙烯醇的研究 I. 共生細菌 SB1的分離及某些性質. 環境科學學報,11(2): 236—241

毛書端,張小平,牛 曼,2012. 2種藻菌固定化改進方法的比較及優化研究. 中國環境科學,32(5): 869—874

李馨子,高 偉,崔志松等,2014. 海洋石油降解菌AlcanivoraxSp.97CO-5的固定化及其石油降解效果. 海洋環境科學,33(3): 383—388

陳 堯,2003. 中國近海石油污染現狀及防治. 工業安全與環保,29(11): 20—24

茆云漢,王建龍,2013. 聚乙烯醇固定化微生物新方法的研究.環境科學學報,33(2): 370—376

鄭 立,崔志松,高 偉等,2012. 海洋石油降解菌劑在大連溢油污染岸灘修復中的應用研究. 海洋學報,34(3):163—172

胡曉亮,周國燕,2011. 海藻酸鈉和溶菌酶復合涂膜對馬陸葡萄貯藏的保鮮效果. 食品科學,32(20): 271—276

段曉琛,盛 軍,徐甲坤等,2013. 海洋脂肪酶ADM47601固定化方法的研究. 海洋與湖沼,44(5): 1311—1317

徐衛東,汪家騮,1999. 海洋石油開發中含油污水處理與溢油防治技術. 油氣田環境保護,9(2): 26—29

曹 暉,彭珍榮,1997. 一種制備珠型固定化細胞顆粒的簡易方法. 微生物學通報,24(4): 254—254

崔志松,李 倩,高 偉等,2013. 復合菌液在模擬溢油岸灘修復中的應用. 應用與環境生物學報,19(2): 324—329

康春莉,高紅杰,郭 平等,2007. 吸附鉛、鎘固定化細菌胞壁多糖小球包埋條件的優化選擇. 生態環境,16(3):825—829

董麗娟,雷 武,夏明珠等,2005. 聚乙烯醇的生物降解. 中國生物工程雜志,25(7): 28—33

賴子尼,崔英德,嚴兆強,2008. PVA-海藻酸鈉-活性炭共聚物水凝膠氧氣滲透性能研究. 材料導報,22(4): 152—155

Chandran P,Das N,2011. Degradation of diesel oil by immobilizedCandida tropicalisand biofilm formed on gravels. Biodegradation,22(6): 1181—1189

Chiellini E,Corti A,D'antone Set al,2003. Biodegradation of poly (vinyl alcohol) based materials. Progress in Polymer Science,28(6): 963—1014

Cui Z S,Lai Q L,Dong C Met al,2008. Biodiversity of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria from deep sea sediments of the Middle Atlantic Ridge.Environmental Microbiology,10(8): 2138—2149

Cunningham C J,Ivshina I B,Lozinsky V Iet al,2004.Bioremediation of diesel-contaminated soil by microorganisms immobilised in polyvinyl alcohol. International Biodeterioration & Biodegradation,54(2—3): 167—174

Dave R,Madamwar D,2006. Esterification in organic solvents by lipase immobilized in polymer of PVA-alginate-boric acid. Process Biochemistry,41(4): 951—955

Díaz M P,Boyd K G,Grigson S J Wet al,2002. Biodegradation of crude oil across a wide range of salinities by an extremely halotolerant bacterial consortium MPD-M,immobilized onto polypropylene fibers. Biotechnology and Bioengineering,79(2): 145—153

Dyksterhouse S E,Gray J P,Herwig R Pet al,1995.Cycloclasticus pugetiigen. nov.,sp. nov.,an aromatic hydrocarbon-degrading bacterium from marine sediments.International Journal of Systematic Bacteriology,45(1):116—123

Elliott C,Ye Z,Mojumdar S Cet al,2007. A potential bacterial carrier for bioremediation. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry,90(3): 707—711

Gentili A R,Cubitto M A,Ferrero Met al,2006. Bioremediation of crude oil polluted seawater by a hydrocarbon-degrading bacterial strain immobilized on chitin and chitosan flakes.International Biodeterioration & Biodegradation,57(4):222—228

Hou D Y,Shen X R,Luo Qet al,2013. Enhancement of the diesel oil degradation ability of a marine bacterial strain by immobilization on a novel compound carrier material.Marine Pollution Bulletin,67(1—2): 146—151

Jansson J K,Bj?rkl?f K,Elvang A Met al,2000. Biomarkers for monitoring efficacy of bioremediation by microbial inoculants. Environmental Pollution,107(2): 217—223

Kim M K,Singleton I,Yin C -Ret al,2006. Influence of phenol on the biodegradation of pyridine by freely suspended and immobilizedPseudomonas putidaMK1. Letters in Applied Microbiology,42(5): 495—500

Kobayashi M,Kanekiyo M,Ando I,1998. A study of molecular motion of PVA/water system by high-pressure1H pulse-NMR method. Polymer Gels and Networks,6(5):347—354

Kostka J E,Prakash O,Overholt W Aet al,2011. Hydrocarbondegrading bacteria and the bacterial community response in gulf of mexico beach sands impacted by the deepwater horizon oil spill. Applied and Environmental Eicrobiology,77(22): 7962—7974

Liang Y T,Zhang X,Dai D Jet al,2009. Porous biocarrierenhanced biodegradation of crude oil contaminated soil.International Biodeterioration & Biodegradation,63(1):80—87

Lin M,Liu Y H,Chen W Wet al,2014. Use of bacteriaimmobilized cotton fibers to absorb and degrade crude oil.International Biodeterioration & Biodegradation,88: 8—12

Long Z -E,Huang Y H,Cai Z Let al,2004. Immobilization ofAcidithiobacillus ferrooxidansby a PVA-boric acid method for ferrous sulphate oxidation. Process Biochemistry,39(12):2129—2133

Lu M,Zhang Z Z,Qiao Wet al,2010. Remediation of petroleum-contaminated soil after composting by sequential treatment with fenton-like oxidation and biodegradation.Bioresource Technology,101(7): 2106—2113

Macnaughton S J,Stephen J R,Venosa A Det al,1999. Microbial population changes during bioremediation of an experimental oil spill. Applied and Environmental Microbiology,65(8): 3566—3574

Matsumura S,Tomizawa N,Toki Aet al,1999. Novel poly (vinyl alcohol)-degrading enzyme and the degradation mechanism.Macromolecules,32(23): 7753—7761

Mishra S,Jyot J,Kuhad R Cet al,2001. Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily-sludgecontaminated soil. Applied and Environmental Microbiology,67(4): 1675—1681

Nu?al S N,Santander-De Leon S M S,Bacolod Eet al,2014.Bioremediation of heavily oil-polluted seawater by a bacterial consortium immobilized in cocopeat and rice hull powder. Biocontrol Science,19(1): 11—22

Obuekwe C O,Al-Muttawa E M,2001. Self-immobilized bacterial cultures with potential for application as ready-to-use seeds for petroleum bioremediation.Biotechnology Letters,23(13): 1025—1032

Ojo O A,2006. Petroleum-hydrocarbon utilization by native bacterial population from a wastewater canal Southwest Nigeria. African Journal of Biotechnology,5(4): 333—337

Pang Y,Zeng G M,Tang Let al,2011. Cr (VI) reduction byPseudomonas aeruginosaimmobilized in a polyvinyl alcohol/sodium alginate matrix containing multi-walled carbon nanotubes. Bioresource Technology,102(22):10733—10736

Pannier A,Oehm C,Fischer A Ret al,2010. Biodegradation of fuel oxygenates by sol-gel immobilized bacteriaAquincola tertiaricarbonisL108. Enzyme and Microbial Technology,47(6): 291—296

Quek E,Ting Y P,Tan H M,2006.Rhodococcussp. F92 immobilized on polyurethane foam shows ability to degrade various petroleum products. Bioresource Technology,97(1):32—38

R?ling W F M,Milner M G,Jones D Met al,2004. Bacterial community dynamics and hydrocarbon degradation during a field-scale evaluation of bioremediation on a mudflat beach contaminated with buried oil. Applied and Environmental Microbiology,70(5): 2603—2613

Surkatti R,El-Naas M H,2014. Biological treatment of wastewater contaminated withp-cresolusingPseudomonas putidaimmobilized in polyvinyl alcohol (PVA) gel. Journal of Water Process Engineering,1: 84—90

Suzuki T,Ichchara Y,Yamada Met al,1973. Some characteristics ofPseudomonas0-3 which utilizes polyvinyl alcohol. Agricultural and Biological Chemistry,37(4):747—756

Tagger S,Bianchi A,Julliard Met al,1983. Effect of microbial seeding of crude oil in seawater in a model system. Marine Biology,78(1): 13—20

Tan L,Li H,Ning S Xet al,2014. Aerobic decolorization and degradation of azo dyes by suspended growing cells and immobilized cells of a newly isolated yeastMagnusiomyces ingensLH-F1. Bioresource Technology,158: 321—328

Van Veen J A,Van Overbeek L S,Van Elsas J Det al,1997. Fate and activity of microorganisms introduced into soil.Microbiology and Molecular Biology Reviews,61(2):121—135

Vogel T M,1996. Bioaugmentation as a soil bioremediation approach. Current Opinion in Biotechnology,7(3):311—316

Wang J L,Liu P,Qian Y,1997. Biodegradation of phthalic acid esters by immobilized microbial cells. Environment International,23(6): 775—782

Wang Y J,Yang X J,Li H Yet al,2006. Immobilization ofAcidithiobacillus ferrooxidanswith complex of PVA and sodium alginate. Polymer Degradation and Stability,91(10):2408—2414

Wang Z Y,Xu Y,Wang H Yet al,2012. Biodegradation of crude oil in contaminated soils by free and immobilized microorganisms. Pedosphere,22(5): 717—725

Xia Y Q,Boufadel M C,2010. The role of stratigraphy and geomorphology on the persistence of the exxon valdez oil spill in Alaska. Geological Society of America Abstracts with Programs,42(1): 94

Xu Y H,Lu M,2010. Bioremediation of crude oil-contaminated soil: comparison of different biostimulation and bioaugmentation treatments. Journal of Hazardous Materials,183(1—3): 395—401