青蛤(Cyclina sinensis)IκB基因的克隆及其在鰻弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表達分析*

魏 星 張海靜 潘寶平

(天津師范大學生命科學學院 天津市動植物抗性重點實驗室 天津 300387)

青蛤(Cyclina sinensis)是我國常見的海產養殖貝類,因其肉質鮮美,營養豐富,目前已成為重要的海水養殖對象之一(高晶等,2015)。但是隨著近年來國內青蛤養殖業的擴大,加之水質污染嚴重,青蛤由病原微生物引起的疾病時有發生(曹華,2004)。其中,鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是引起海洋生物死亡的一種主要的革蘭氏陰性菌,并且對青蛤有明顯毒害作用(葛端陽等,2012)。由于青蛤缺乏特異性免疫系統,僅僅依賴其先天性免疫系統防御入侵的病原微生物。因此,對免疫信號通路相關分子的研究有助于更深入地了解軟體動物的先天性免疫防御機制,為貝類養殖疾病防控提供新思路。

無脊椎動物為先天性免疫防御系統,也稱為非特異性免疫(Iwanagaet al,2005)。非特異性免疫系統可以通過 Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)對病原相關分子模式(PAMPs)的識別,從而激活下游信號通路,最終導致入侵病原體的清除(Janewayet al,2004)。所有的 Toll樣受體家族成員均依賴于 TIR(Toll/IL-1R homologous region)結構域向細胞內轉導其識別的信號。一類包含 TIR結構域的接頭分子如MyD88、TIRAP、TRIF、TRAM可募集到不同的Toll樣受體(張煒等,2006),TLRs信號通路依據接頭分子的不同可以分為 MyD88依賴型信號通路和 MyD88非依賴型信號通路(Akiret al,2004)。在TLRs 信號通路中,IκB (inhibitor of NF-κB)是一類重要的信號分子,是核轉錄因子 κB (Nuclear factor-κB,NF-κB)的抑制蛋白(Vallabhapurapuet al,2009)。在沒有受到刺激的細胞中,NF-κB二聚體通過與IκB結合而以失活狀態存在于細胞質中。當受到外界刺激后,IκB通過磷酸化和泛素化而被蛋白酶降解,活化的 NF-κB隨即轉位到核內與其相關的DNA基序結合以誘導靶基因的轉錄(Baldwin,1996)。

IκB家族成員存在三個特征結構域: 錨蛋白重復序列(ankyrin repeat,ANK),ANK是哺乳動物中與NF-κB蛋白相互作用的重要結構域; N端調控區,包含兩個保守的絲氨酸殘基及降解序列(degradation motif); 以及PEST結構域(PEST motif),富含脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、以及蘇氨酸殘基(Baldwin,1996)。在哺乳動物中 IKBs有 7種結構類型,其中 IκBa、IκBβ、IκBε這 3 種 IκB 含有 N 端調控區(郭偉等,2006)。近年來,在一些海洋雙殼類軟體動物中也發現了IκB基因,例如合浦珠母貝、海灣扇貝、菲律賓蛤仔、太平洋牡蠣、文蛤(Zhanget al,2009,2011; Muet al,2010; Yanget al,2011; Leeet al,2013),它們對病原微生物刺激的研究結果表明,IκB基因參與這些生物的先天免疫信號轉導。

1 材料與方法

1.1 實驗青蛤

青蛤采自于天津市大港灘涂,選取平均殼長(29.12±1.49)mm,平均殼高(29.86±1.57)mm,平均殼寬(19.56±0.47)mm的個體,暫養于通氣海水中,水溫20—23°C,海水密度 1.020—1.040 g/cm3,海水 pH 7.0,投喂5‰的小球藻,一周后進行試驗。

1.2 菌種

實驗室保存的鰻弧菌用2216E培養基于28°C下培養24h。

1.3 侵染實驗

將培養好的鰻弧菌用無菌海水洗脫,濃度調至OD600=0.4 (1OD = 1×108bacteria/mL)。實驗隨機分組,每次設10個平行組。在注射前稱取青蛤閉殼肌、鰓、肝臟、外套膜和性腺各 50mg,并迅速放入裝有液氮的預冷研缽中按 1∶9的質量體積比加入預冷生理鹽水并研磨,研磨后于4°C,4500 r/min離心15min,取上清液備用。實驗組的每只青蛤注射50μL鰻弧菌菌液,空白組注射等量滅菌的生理鹽水,對照組注射等量的滅菌海水。分別于注射后0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、96h提取血淋巴,并于 4°C條件下,8000 r/min離心10min,收集血細胞,加入1mL Trizol,置于–80°C超低溫冰箱以備使用。

1.4 轉錄組文庫的構建及篩選

Trizol法提取健康青蛤各個組織的總RNA,使用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits法分離純化總RNA。純化后的 mRNA用隨機引物逆轉錄法合成cDNA。純化的雙鏈cDNA再經末端修復、加尾等步驟完成整個文庫制備。采用Illumina MiSeq二代測序儀完成轉錄組測序。去冗余后的數據采用Unigene編碼蛋白框ORF預測分析,并與NR數據庫等BLAST比對分析,通過Blast2GO軟件完成Unigene的GO注釋。根據KEGG數據庫注釋并進一步對Unigene進行Pathway通路的注釋和預測(Panet al,2015),從中篩選得到青蛤IκB (CsIκB)基因類似序列。

1.5 生物信息學分析

根據從轉錄組文庫中篩選出的 CsIκB基因類似序列設計特異性引物 CsIκB-S、CsIκB-A (表 1)進行基因克隆并測序后與 GenBank核酸數據庫進行BLASTX (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)分析; ORF Finder (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)預測開放閱讀框(ORF); ProtParam工具在線預測序列的分子式、分子量和等電點; ExPASy (http: //web.expasy.org/compute_pi/)分析蛋白質性質; SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)查找蛋白質結構域; PEST find 用于預測 PEST結構域(http: //www.at.embnet.org/toolbox/pestfind/),Proscan (http: //pbil.ibcp.fr/)用于推斷酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點。使用 ClustalX1.83對氨基酸序列進行比對,根據鄰接法(NJ),使用MEGA4.1構建基因系統進化樹,采用 bootstrap1000個循環檢驗拓撲結構的置信度。

1.6 Cs IκB基因在各組織內的表達分析

表1 本研究所用PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences used in this study

參照1.3方法,將青蛤肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓和性腺的上清液與青蛤注射后0h的血細胞分別置于1mL TRIZOL中提取總RNA,并根據TaKaRa公司的PrimerScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說明反轉錄成cDNA,以cDNA為模板,β-actin基因為內參基因進行實時熒光定量PCR。根據β-actin基因和克隆得到的 CsIκB基因序列分別設計引物為:β-actin F、β-actin R、CsIκB-F、CsIκB-R (表 1)。反應體系為20μL,在Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀上進行,反應程序為: 95°C 30s; 94°C 5s,60°C 30s,72°C 30s,40 個循環。采用 2-ΔΔCT法計算 Cs IκB 基因表達量(Livaket al,2001),并使用SPSS軟件進行數據分析。

1.7 鰻弧菌刺激后Cs IκB基因在血淋巴內的時序性表達

分別利用1.2.1方法中鰻弧菌刺激后0h、3h、6h、12h、24h、48h、96h的血細胞提取總 RNA,并反轉錄成 cDNA進行實時熒光定量 PCR,方法及引物同1.6。反應程序為: 95°C 30s; 95°C 5s,58°C 30s,72°C 30s,40個循環。采用2-ΔΔCT法處理數據,使用SPSS軟件對同一時間點的實驗組和對照組以及實驗組與空白組的表達量進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 Cs IκB基因的序列分析

從青蛤轉錄組文庫篩選得到 CsIκB基因類似序列,設計引物克隆并測序,BLASTX進行序列比對及ORF分析后結果顯示CsIκB基因cDNA序列ORF為1134bp,預測編碼 377個氨基酸(圖 1),分子量為41.79 kDa,等電點為 4.98,氨基酸組成中亮氨酸(Leu)含量最高,占10.6%。C端存在6個ANK。N端存在DS64GILS68序列,與保守的DSGXXS降解序列一致。利用 PEST序列查找軟件分析表明,CsIκB不存在PEST結構域,但是C端存在保守的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(S373DDES377),通常位于 PEST結構域。Cs IκB基因在GenBank中的注冊號為KP067202。

2.2 Cs IκB基因的系統進化分析

經GenBank BLASTX研究表明,Cs IκB基因氨基酸序列與菲律賓蛤仔 IκB(Ruditapes philippinarum,ACF93446)基因的氨基酸序列同源性最高,達到 59%,與海蝸牛(Aplysia californica,XP_005111546)、長牡蠣(Crassostrea gigas,ADX06856)、布氏新亮麗鯛(Neolamprologus brichardi,XP_006792655)、合浦珠母貝(Pinctada fucata,ACF93446)和紅鮑(Haliotis rufescens,AGZ03662)IκB基因的氨基酸序列同源性為40%、40%、41%、42%和44%。利用無脊椎動物和脊椎動物代表性的 IκB氨基酸序列構建的系統進化樹顯示(圖 2),無脊椎動物與脊椎動物的 IκB氨基酸序列出現一個明顯的進化分歧。CsIκB基因與菲律賓蛤仔IκB基因聚為一支,與其它無脊椎動物IκB基因聚類。

2.3 Cs IκB基因在各組織間的表達

通過實時熒光定量PCR技術檢測CsIκB基因在青蛤不同組織中的表達情況,結果顯示,CsIκB基因在所檢測的血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓和性腺 6種組織中均有表達,并且在血淋巴中表達量最高,其次為閉殼肌和性腺,而在肝臟中表達量最低(圖3)。

2.4 Cs IκB基因在鰻弧菌刺激下的表達

青蛤在鰻弧菌侵染刺激后,在青蛤血淋巴中的CsIκB基因的時序性表達情況如圖4所示,實驗組的表達量在刺激后 3h迅速升高,與對照組及空白組相比均有極顯著性差異(P＜0.01); 在6h時表達量達到最大值,約為對照組的 2.3倍左右,并且與對照組及空白組均差異極顯著(P＜0.01)。表達量于6h后開始下降,并逐漸接近正常水平。對照組沒有顯著性變化。

3 討論

本研究從青蛤轉錄組文庫中篩選并進一步克隆得到了TLRs通路信號分子CsIκB的cDNA序列。分子系統學分析表明,CsIκB在從無脊椎動物到脊椎動物不同物種的進化上極為保守,青蛤、菲律賓蛤仔海灣扇貝等軟體動物動物的 IκB聚為一類。由此推測,這些軟體動物IκB蛋白有相似的生物學功能,在其先天性免疫防御中起著重要作用。CsIκB基因包含6個ANK,降解域以及保守的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點。研究發現合浦珠母貝、海灣扇貝、菲律賓蛤仔、太平洋牡蠣(Zhanget al,2009,2011; Muet al,2010; Leeet al,2013)等的IκB基因也存在6個ANK,然而文蛤的IκB基因存在5個 ANK (Yanget al,2011)。ANK數量的差異可能與其相互作用的 NF-κB/Rel蛋白的不同有關。

根據前人對哺乳動物IκB基因的研究表明,降解域中絲氨酸殘基的磷酸化是由多種細胞外刺激介導的(Luqueet al,2000)。特別是IKK激活IκB的降解域,導致泛素化和蛋白酶體降解(Schmidet al,2008)。CsIκB基因 N端存在保守的降解域(DS64GILS68),表明 CsIκB可能同樣是由 IKK 和 NF-κB調節的。IκB基因的C端通常存在PEST結構域,會導致含有它們的細胞內蛋白的快速降解(Rogerset al,1986)。然而CsIκB 基因與一些軟體動物的 IκB 基因一樣缺少PEST結構域,如合浦珠母貝、海灣扇貝、太平洋牡蠣(Zhanget al,2009,2011; Muet al,2010)。但是CsIκB的 C端存在酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(S373DDES377),說明也許一些IκB基因的降解不需要PEST結構域,而是酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點起到關鍵作用。

圖1 CsIκB基因的cDNA序列的開放閱讀框及推導的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence of CsIκB ORF and its deduced amino acid sequence方框且加粗部分代表起始密碼子,*代表終止密碼子,下劃線代表降解域,圓圈部分代表保守的絲氨酸殘基,灰色底紋部分代表6個ANK,方框代表酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點

哺乳動物 IκB蛋白在不同組織的表達差異是由于它們對NF-κB二聚體的親和力不同所致(Hoffmannet al,2006)。也是由于NF-κB參與多種生理過程,如免疫反應、炎癥反應、細胞增殖和凋亡、細胞應激反應以及組織重建(Liet al,2002)。本研究通過實時定量PCR技術分析了 CsIκB基因在青蛤不同組織中的表達情況,結果顯示CsIκB基因在青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌、鰓和性腺6種組織中均有表達但表達量不同,表明 NF-κB基因作為一種多效性的轉錄因子在各個組織中被屏蔽的程度不同。CsIκB基因在血淋巴中的表達量最高,該結果與合浦珠母貝poI-κB、菲律賓蛤仔 Rp-IκB、太平洋牡蠣 IκB1 (Zhanget al,2009,2011; Leeet al,2013)在血淋巴中的表達情況相似。血淋巴是軟體動物免疫系統的重要組成成分,介導了軟體動物內部防御中對于入侵病原微生物的吞噬和包埋作用(Humphrieset al,2003)。

圖2 CsIκB和其它物種的IκB氨基酸序列構建的系統樹Fig.2 The phylogenetic tree constructed by the amino acid sequence of CsIκB and IκBs from other species建立系統樹所用的物種以及序列號為: Drosophila melanogaster (AAA85908); Haliotis diversicolor (AHM27300); Haliotis rufescens(AGZ03662); Meretrix meretrix (ADK74377); Pinctada fucata (ACF93446); Aplysia californica (XP_005111546); Ruditapes philippinarum(AEB92230); Crassostrea gigas (ADX06856); Argopecten irradians (ACZ34178); Mytilus galloprovincialis (AHI17300); Homo sapiens IκBa,IκBβ,IκBε (NP_065390,AAH15528,AAC51216); Mus musculus IκBa,IκBβ,IκBε (AAH46754,AAH21938,AAH30923); Rattus norvegicus IκBa,IκBβ (Q63746,AAH85729); Neolamprologus brichardi (XP_006792655); Cyclina sinensis (KP067202)

圖3 CsIκB基因在青蛤不同組織中的表達分布Fig.3 The distribution of CsIκB expression in different tissues of C. sinensis不同小寫字母代表差異顯著(P＜0.05),不同大寫字母代表差異極顯著(P＜0.01)

為了揭示 CsIκB基因在青蛤免疫體系中的作用機制,本研究進一步檢測了青蛤血淋巴中CsIκB基因在鰻弧菌刺激不同時間后的表達量,結果表明;CsIκB基因在刺激后3h上調,6h后其表達量開始下降,并逐漸恢復至正常水平。與合浦珠母貝、菲律賓蛤仔、太平洋牡蠣、文蛤(Zhanget al,2009,2011; Yanget al,2011; Leeet al,2013)的研究結果類似,說明CsIκB基因參與了青蛤的先天性免疫信號轉導。CsIκB的誘導機制可能是通過TLRs信號通路識別病原微生物,從而引發下游信號級聯反應(Kratsovniket al,2005)。已有研究顯示,在櫛孔扇貝中存在一條原始的 MyD88依賴型TLRs信號通路(Wanget al,2011)。目前我們已克隆得到青蛤 TLR2基因,以及 MyD88依賴型TLRs信號通路中最關鍵的接頭分子MyD88,并證明它們參與了青蛤的先天性免疫反應(任毅鵬等,2014;高晶等,2015),本研究克隆得到TLRs信號通路下游重要的信號分子CsIκB基因的cDNA序列,這些研究表明青蛤可能存在一條TLRs信號通路并且該通路參與了青蛤對于鰻弧菌刺激的免疫應答。

圖4 鰻弧菌刺激下在青蛤血淋巴中CsIκB基因的時序性表達情況Fig.4 The temporal expression of CsIκB in hemocytes after V.anguillarum stimulation##代表該時間點實驗組基因的表達量同組注射前(0h)相比差異極顯著(P＜0.01),**代表相同時間點實驗組與對照組基因的表達量差異極顯著(P＜0.01)

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