高效分解水產原料的菌株分離鑒定和組合發酵初探*

宋 敏 劉 為 張鷹炯 童曉倩 李 鵬 王 斌 羅紅宇①

(1. 浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室 浙江海洋學院食品與醫藥學院 舟山 316022;2. 岱山縣綠康源海洋生物技術有限公司 舟山 316200)

隨著水產品加工業的迅速發展,加工產量逐年遞增的同時,產生了大量的下腳料,如魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、魚內臟、魚骨、魚膽、魚鰾、蝦殼、蟹殼、貝類及其殘留魚肉,其重量約占原料魚的40%—55%(李晶,2012)。隨著漁業資源的衰退,目前漁獲物產量中有相當數量的低值雜魚,這類雜魚和水產下腳料統稱為低值水產蛋白資源(以下簡稱低值水產品),其中的大部分作為初飼料被利用,部分甚至被廢棄,不僅污染環境,還造成資源浪費(孫靜等,2013)。低值水產品中含有豐富的營養物質和功能活性物質。目前,雖然國內對低值水產品開展了一些初級的利用,如將魚頭、魚骨加工成魚骨糊、魚骨粉,從魚內臟中提取魚油等(孫曉蓮,2009),但這些途徑對下腳料的利用仍然較為低效低值,還會有剩余的下腳料被拋棄到環境中,因此亟待對低值水產品進行深度高值開發。

目前,國內外有關利用微生物降解石油、修復石油污染以及用微生物處理廢水污水等(Moriartyet al,2012)已有較多報道,微生物利用動物糞便、稻殼、污泥和秸稈等發酵生產菌肥方面的研究也很多。如張士萍等(2008)從受石油污染土壤中篩選及馴化得到以機油為唯一碳源進行生長代謝的混合菌種,該混合菌種對高濃度含機油廢水具有較強的降解能力。宋鵬等(2008)利用生活垃圾以及污泥混合物為原料,接入有機物料腐熟固體混合菌劑和有益菌群混合菌懸液,生產微生物菌肥。但有關利用微生物降解發酵低值水產品的報道在國內外較少。如辜瀾濤等(2012)利用微生物對豆渣、魚雜、雞血等進行發酵處理,結果顯示發酵液中的粗蛋白含量最高,營養價值也得到有效提高。本文從現有的一種組成未知的復合菌入手,對其進行分離純化、鑒定以及發酵菌種的探究,從而確定可以降解低值水產品的主要微生物類群以及發酵菌種配方,為進一步研究微生物發酵低值水產品制備菌肥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

1.1.1 未知復合菌 由岱山縣綠康源海洋生物技術有限公司提供。

1.1.2 低值雜魚和水產下腳料 購自舟山市第一漁業公司冷庫。

1.1.3 培養基 復合菌活化用培養基為液體肉膏蛋白胨培養基(0.5g牛肉膏,1.0g蛋白胨,0.5g氯化鈉,水100mL,pH 7.2)。菌種活化用培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基和營養瓊脂培養基,青島高科技工業園海博生物技術有限公司。種子液制備用培養基為馬鈴薯液體培養基(將200g馬鈴薯去皮切碎,煮爛后取得土豆汁,加入 20g葡萄糖或者蔗糖,加水至1000mL)和 LB培養基(胰蛋白胨 10g/L,酵母提取物5g/L,氯化鈉5g/L)。發酵用培養基[10%(W/V)經絞碎的低值水產品,90%的蒸餾水]。

1.1.4 主要試劑和儀器 寶生物DNA提取試劑盒,大連 TaKaRa公司; PCR反應用的各種試劑,大連TaKaRa公司; 梅里埃 API試劑條,北京三佳拓聯科技發展有限公司; LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠; HZQ-F160全溫振蕩培養箱,太倉市豪成實驗儀器制造有限公司; SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司; BPS-250培養箱,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;722G可見分光光度計,上海精密科學儀器有限公司;AR224CN 電子分析天平,美國奧豪斯儀器(上海)有限公司; OLYMPUS CX21顯微鏡,上海優浦科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌粉活化 在超凈臺內稱取 0.1g菌粉添加到盛有50mL無菌的肉膏蛋白胨液體培養基的錐形瓶中,置于恒溫搖床,28°C,120 r/min,培養24h。

1.2.2 菌種的分離純化 考慮到復合菌的廣譜性,要想從中篩選出適合分解低值水產品的菌株,用一般的細菌、真菌分離培養來篩選無法達到目的,因此考慮用低值水產品制備分離用培養基來篩選出生長良好的菌株作為供試菌。

1.2.2.1 分離培養基的制備

培養基成分: 取一定量的低值水產品,加入蒸餾水制成含原料分別為10%,5%,2%,1%,0.5%,0.1%的勻漿液,然后加入一定量的瓊脂制成固體培養基。倒平板用于菌種分離,根據菌種生長情況來確定培養基中水產原料的最適濃度。

1.2.2.2 涂布分離純化

在無菌條件下,將活化的復合菌稀釋至 10–6,取不同稀釋梯度的液體均勻涂布于對應標號的低值水產品固體培養基中,選擇其中生長密度適宜的平板,根據菌落表面結構、形態、顏色、透明度及邊緣等狀況,用接種環挑取上面生長的單個菌落,多次劃線分離得到的單菌落,用制備好的低值水產品試管斜面保存于4°C冰箱中,作為供試菌株用于后續實驗。

1.2.3 菌種的鑒定

1.2.3.1 形態觀察與鏡檢

用接種環從低值水產品斜面培養基上取少量菌種,在低值水產品平板培養基上劃線,培養后觀察菌落的特征,培養特征觀察參照文獻(魏景超,1979;東秀珠等,2001),菌株形態特征在光學顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 API試劑條法對菌株鑒定

API20 C AUX: 將平板培養2—3d的菌體,用接種環取少許加入API suspension培養基(或0.85%生理鹽水)混勻,使得溶液濃度為 2Mcf,然后從中吸取100ul加入到API C培養基中,混勻后將液體分別加入相應試劑盒各孔內,(29±2)°C靜置培養 72h,分別在48h和72h時觀察試劑盒各孔的變化,最后將實驗結果輸入apiwebTM鑒定軟件進行分析。

API50 CHB/E: 將平板培養24h的菌體用無菌生理鹽水洗兩次后,加入 API 50 CHB/E培養基(或0.85%生理鹽水)混勻,然后將混有菌體的 API 50 CHB/E培養基(或0.85%生理鹽水)分別加入相應試劑盒各孔內,37°C靜置培養48h,觀察試劑盒各孔顏色的變化,最后將實驗結果輸入 apiwebTM鑒定軟件進行分析。

1.2.3.3 分子鑒定

分別參照寶生物真菌和細菌基因組DNA提取試劑盒說明操作,完成菌種 DNA提取。真菌擴增采用通用引物 EF3(5’-TCCTCAAATGACCAAGTTTG-3’)和 EF4(5’-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3’) (Whiteet al,1990); 細菌擴增采用通用引物 27F(5'-AGAGT TTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-3') (武香玉等,2012)。PCR擴增體系(25μL): 10μL ddH2O,12.5μL PCR-mix,引物各1μL,0.5μL 模板。PCR 擴增程序: 預變性 95°C、5min;94°C變性1min,55°C退火1.5min,72°C延伸2min,共30個循環; 72°C最終延伸 10min (Andrewet al,2011;Bernardiet al,2000; Chenet al,2010)。擴增產物用含 EB的 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、拍照。純化的目的DNA送美吉生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結果在GenBank中通過BLAST進行基因比對,獲得相似度較高的序列后,與所測序列通過 ClustalX進行多重序列比對,比對結果通過MEGA 4.0軟件構建系統發育樹(敖曉琳等,2011)。

1.2.4 菌株生長曲線的測定 主要通過分光光度計,采用光電比濁計數法測定菌液濃度(鄭朝成等,2012)。將被測菌用相應平板進行活化,然后用接種環取一環已活化的菌株接入裝有50mL相應種子液培養基的錐形瓶中,于28°C,160 r/min振蕩培養,每隔2h測定菌株各個時間點的吸光值(OD600)大小。以培養時間為橫坐標,OD600值為縱坐標作圖,并將各點連接成一條平滑曲線,即為該菌在相應液體培養基中,28°C、160 r/min條件下培養的生長曲線。

1.2.5 單菌種發酵效果的測定 將每種菌按發酵液 5%接種量分別接入到含 5g絞碎的水產原料和45mL水的250mL的錐形瓶中,混勻放入全溫振蕩培養箱,自然pH,28°C,160 r/min,發酵72 h后測定發酵液游離氨基酸態氮含量,每組三個平行。

氨基酸態氮標準曲線的制作見參考文獻(彭愛紅等,2002),樣品游離氨基酸態氮含量的測定以參考文獻(賈雅麗,2010)的方法進行。

1.2.6 發酵菌種組合篩選 以各菌株的功能特性為基礎,根據發酵原料特點和目標產物的要求,設計不同的菌株組合。每種組合按發酵液 5%接種量接入到含5g絞碎的水產原料和45mL水的250mL的錐形瓶中,混勻放入全溫振蕩培養箱,自然 pH,28°C,160 r/min,發酵 72 h后測定發酵液游離氨基酸態氮含量,每組三個平行。

2 結果

2.1 菌種分離培養基的確定

觀察菌株在不同培養基中涂布生長的情況表明,在水產原料含量為1%、0.5%、0.1%的三種培養基中菌落生長相似,個體很小,可能是培養基營養物質不夠所致,但菌落密集無法計數; 在原料含量為10%、5%、2%的三種培養基中菌落生長也相似,菌落飽滿個體較大,生長密集,無法計數。綜合考慮菌種既能正常生長又可以節約原料,確定實驗所用菌種分離培養基中水產原料的含量為2%。

2.2 菌種的初步鑒定結果

混合菌種的稀釋分離結果表明,稀釋梯度為10–3、10–4時,菌落清晰相間,為適宜的稀釋梯度,觀察生長密度適宜的平板,根據菌株的形態差異,共分離得到4株菌,分別命名為菌株a、b、c、d。各菌種形態特征和顯微特征見表1。

表1 4株菌的形態特征和顯微特征Tab.1 Morphological and microscopic characteristics of 4 strains

2.3 API生化鑒定結果

API生化試驗條法對4株菌的生化性質具體鑒定結果見表2和表3 ,結果與反應鑒定表比對,并參考文獻(魏景超,1979; 東秀珠等,2001)。由表2可知,所分離到的菌株a 與標準菌株Candida tropicalis性質基本一致,可認為a菌為熱帶假絲酵母。所分離到的菌株b 與標準菌株Cryptococcus laurentii性質基本一致,可判斷b菌為羅倫隱球菌。由表3可知,所分離到的菌株c與標準菌株Bacillus subtilis性質基本一致,可判斷 c菌為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。所分離到的菌株 d與標準菌株Bacillus cereus性質基本一致,可判斷d菌為蠟樣芽胞桿菌。

2.4 菌株分子鑒定結果

以 16SrDNA和 18S rDNA基因序列測定并與NCBI 數據庫中的序列進行同源性比較,將同源性較高的典型菌株的序列用于構建系統發育樹,如圖1和圖2所示。

根據真菌18S rDNA序列構建的系統發育樹可以看出,a菌株與標準菌株Candidasp.親緣關系最為接近,其18S rDNA的同源性達到99%,且與相應的標準菌株Candida tropicalis的序列相似度為94%; b菌株與標準菌株Cryptococcus laurentii聚在一起,其18S rDNA的同源性達到100%。因此,結合菌株形態學特征、生長特性和生理生化特性,可以確定菌株 a為熱帶假絲酵母Candida tropicalis,菌株b為羅倫隱球菌Cryptococcus laurentii。

根據細菌16S rDNA序列構建的系統發育樹可以看出,c菌株與標準菌株Bacillus subtilis親緣關系最為接近,其16S rDNA的同源性達到99%; d菌株與標準菌株Bacillus cereus聚在一起,其18S rDNA的同源性達到100%,因此,結合菌株形態學特征、生長特性和生理生化特性,可以確定菌株c為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis,菌株 d為蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus。

表2 菌株a、b的主要生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain a and b

表3 菌株c、d的主要生理生化特性Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of strain c and d

圖1 以18S rDNA序列為基礎的2株菌系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 2 strains based on 18S rDNA sequence

2.5 4株菌的生長曲線

4株菌各自在馬鈴薯液體培養基(菌株 a和 b)和 LB培養基(菌株 c和 d)中的生長曲線,如圖 3所示。

圖2 以16S rDNA序列為基礎的2株菌系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the 2 strains based on 16S rDNA sequence

圖3 4株菌生長曲線Fig.3 The growth curve of 4 strains in potato medium or LB medium

如圖3所見,4株菌的生長曲線表現出較為典型的 4個特征時期: 延滯期、對數增長期(指數期)、穩定期和衰亡期。株菌c和d大約在接種4h左右進入對數生長期,OD值開始迅速上升; 菌株a和b大約在接種6h左右進入對數生長期,OD值開始迅速上升。由于養料、空間等問題,對數期結束后,菌種開始進入平穩期,從圖3中可以看出,這4株菌進入平穩期的時間大約都在12h左右。在衰亡期時,細胞死亡率增加,菌株少繁殖或不繁殖,4株菌進入衰亡期的時間也大約都在16h左右。

由于制備后續發酵所需的種子液需取至處于對數時期的菌種,通過圖表可見,如需一同制備4株菌的種子液,只要取至培養時間在 6—12h之間的菌種即可。

圖4 游離氨基酸態氮標準曲線Fig.4 Standard curve of free amino acid nitrogen

2.6 游離氨基酸態氮標準曲線

以OD值為橫坐標,游離氨基酸態氮含量為縱坐標,得到游離氨基酸態氮標準曲線如圖4所示。經統計分析,得線性回歸曲線為:y=121.98x–1.2967,R2=0.9982,說明曲線可信度較高,可以運用(馮培勇等,2009)。

2.7 單菌種發酵效果

圖5 單菌種發酵效果Fig.5 The ferment effect of a single strain

單菌種發酵低值水產品后游離氨基酸態氮的含量,如圖5所示。不同菌種發酵后游離氨基酸態氮的含量較對照組都有一定的上升,其中 c菌株(枯草芽孢桿菌)和 d菌株(蠟樣芽胞桿菌)發酵后游離氨基酸態氮含量上升較多,約為 4g/L。其次是 a菌株(熱帶假絲酵母),發酵后游離氨基酸態氮含量上升2.365g/L。發酵效果最弱的是b菌(羅倫隱球菌),發酵后游離氨基酸態氮的含量僅上升1.068g/L。每種菌發酵低值水產品的能力各異,這可能與各種菌的特性和發酵過程中各菌種產生的酶的種類有一定相關性。此試驗結果結合菌株解磷解鉀固氮試驗結果,可以為下一步設計不同菌株組合進行混合發酵奠定基礎。

2.8 混合發酵菌株最佳組合的篩選

不同菌種組合混合發酵低值水產品后游離氨基酸態氮的含量,如圖6所示。不同菌種組合發酵后游離氨基酸態氮的含量較對照組均有明顯上升,相比對照組分別上升了 3.943、3.034、5.927、3.492、8.276、4.445、4.859g/L。其中,acd菌株組合發酵后游離氨基酸態氮含量上升最顯著,效果明顯優于其它組合的發酵效果,很有可能是當這三菌株共存在同一個環境時,可以達到一個良好的協同作用,互利共存狀態。故可確定最佳發酵菌株配方為acd(熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+蠟樣芽胞桿菌),下一步實驗將選此最佳組合進行。

圖6 不同組合菌株發酵效果Fig.6 The ferment effect of different strains combination

3 討論

低值水產品作為廢物直接丟棄,不僅導致資源浪費、產品附加值低,而且造成海洋、陸地環境的嚴重污染(白福玉等,2007),這是水產養殖與加工業規模化與集約化發展過程中不可避免的一個現實問題。目前,利用微生物處理是一種較為簡單易行和有效的方法,具有較好的應用前景。但要切實做好低值水產品的微生物發酵利用,關鍵在于如何篩選得到具有高效分解功能的微生物菌株。為此,本試驗通過用低值水產品制備的分離培養基來篩選出生長良好的菌株作為優勢菌,分離培養后,進行生理生化以及分子鑒定,最終從一種組成未知的復合菌中篩選得到 4株具有較好分解低值水產品作用的微生物菌株,分別為a熱帶假絲酵母、b羅倫隱球菌、c枯草芽孢桿菌、d蠟樣芽胞桿菌,這為下一步微生物發酵奠定了物質基礎。

本實驗中分離得到的菌株主要為芽孢桿菌和酵母菌,這說明降解低值水產品的主要微生物類群為這兩大類。芽孢桿菌內生芽孢,繁殖能力強,有利于工業化生產,又是非致病細菌,對人畜無害,不污染環境。研究發現,芽孢桿菌屬菌株廣泛分布于自然界中,能抗許多不良環境(Garrityet al,2004)。且芽孢桿菌屬細菌可以自身合成分泌胞外蛋白酶(Mehrotraet al,1999)、淀粉酶(Asgheret al,2007)、脂肪酶(Chenet al,2007)等酶類。芽孢桿菌屬中的蠟樣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌是目前應用較廣的菌肥微生物,司麗娜(2012)從多種市售微生物肥料、植物根際土壤中進行微生物菌種分離篩選,其中芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌被廣泛應用于微生物菌肥的制備中。假絲酵母菌為酵母型真菌,通過發芽而繁殖,可形成假菌絲。假絲酵母是國內外研究較多的產脂肪酶、木糖醇的菌種(Silvaet al,2012),以及在生產菌體蛋白等方面也有相關報道。張厚瑞等(2007)自木糖廠環境樣品中分離出一株編號為1—18的高產木糖醇分離物,經鑒定該分離物屬于為熱帶假絲酵母。另外,我國在利用假絲酵母等微生物以木薯渣(陳桂光等,1997)、秸稈(白坤等,1998)、玉米皮渣(郭維烈等,1996)為原料生產菌體蛋白方面也做了較多研究。隱球菌屬下的物種通常棲息在土壤中,對人類無害。近年來,國內外在利用羅倫隱球酵母產胞外多糖、脂肪酶等方面研究較多,以及在水果采后病害的生物防治方面也有相關報道(Yurkovet al,2013)。梁寧等(2009)以蒜薹為試材,研究了羅倫隱球酵母對引起蒜薹采后病害的主要病原菌交鏈孢霉菌的生物防治作用,這顯示了隱球酵母在蔬果病害防治方面存在巨大的應用前景。

復合微生物肥料是近年來研究較多的一種肥料,內含菌種數量較多,種類復雜,主要有放線菌、芽孢桿菌、酵母菌、霉菌等,這類產品種類多,應用較為廣泛且效果顯著。目前已經應用的復合微生物肥料有澳大利亞研制的由不同種的根瘤菌組成的復合根瘤菌肥料、美國的“生物一號”接種劑和日本“EM”等多個品種(葛誠,1994)。1994年我國山東省濰坊市從日本引進一種菌肥-酵素菌,它是從土壤和其它物質中分離出來并高倍繁育,由 20多種有益微生物組成的菌種群體,可高效分解木屑及植物秸稈等物質,產生大量的腐殖質和可被植物吸收利用的氮、磷和鉀及各種微量元素(謝明杰等,2000)。施用后,大大改善了土壤的性質,作物產量成倍增加。

由于進口商用復合菌的市場價格昂貴,工業化生產成本高,在我國農業應用中還未能普及。本試驗從分離純化所得的4株菌種出發,以各菌株的功能特性為基礎,根據發酵原料特點和目標產物的要求,并進一步以游離氨基酸態氮為指標,通過單菌種發酵試驗和多菌種組合發酵試驗,得出多菌種混合發酵的效果明顯優于單菌種發酵,且菌株組合acd(熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+蠟樣芽胞桿菌)的發酵效果最好,可以作為發酵低值水產品制備菌肥的菌株配方,為后續發酵工藝研究、制備菌肥等提供思路。

4 結論

利用低值水產品培養基從一種組成未知的復合菌中篩選出高效分解下腳料的菌株a、b、c、d。通過形態學、生理生化指標和16S rDNA、18S rDNA系統發育樹構建等對其進行了鑒定。 就菌種的鑒定角度而言,現在普遍采用形態學指標結合分子生物學鑒定來進行綜合鑒定,因此,可認為菌株 a為熱帶假絲酵母,菌株b為羅倫隱球菌,菌株c為枯草芽孢桿菌,菌株d為蠟樣芽胞桿菌。并以各菌株的功能特性為基礎,根據發酵原料特點和目標產物的要求,以游離氨基酸態氮含量為指標,通過單菌種發酵試驗和多菌種組合發酵試驗,篩選出最佳發酵菌種組合為acd(熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+蠟樣芽胞桿菌),為后續微生物菌肥的研制奠定了基礎。

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