環介導等溫擴增聯合橫向流動試紙條快速檢測扁滸苔(Ulva compressa)的研究*

陳先鋒 周前進 王瑞娜 段維軍 苗 亮 陳 炯①

(1. 寧波大學海洋學院 寧波 315211; 2. 寧波檢驗檢疫科學技術研究院 寧波 315012)

扁滸苔(Ulva compressa)是屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、石莼屬的一種大型藻類。石莼屬(Ulva)藻類呈全球性分布,常見于海洋環境,半咸水或江河水中也有分布,多生長于潮間帶的巖石上或石沼中,或泥沙灘的石礫上,在大型海藻的藻體和船舶外殼上也可附生。其中,扁滸苔(U. compressa)、滸苔(Ulva prolifera)、腸滸苔(Ulva intestinalis)等在我國的海洋野生植物中分布極為豐富,是重要的經濟藻類,含有許多人體必需的營養成分,可食用,也具有重要的藥用價值(Hiqashi-Okajet al,1999; Ramanet al,2004; Mamathaet al,2007)。同時,扁滸苔、滸苔等石莼屬藻類也是引起綠潮災害的主要生物種類(Duanet al,2012; Huoet al,2013; Liuet al,2013b; Smetaceket al,2013)。近幾年,在黃海、東海等沿海水域由石莼屬引發的綠潮災害對當地的海洋生態系統及相關產業造成了巨大危害(Yeet al,2011; Huoet al,2013; Liuet al,2013a,b)。

目前,石莼屬等綠潮藻類的鑒定仍以傳統的藻類培養,形態學觀察為主(Culverhouseet al,1996)。該方法不僅操作繁瑣(需定期更換培養液)、培養周期過長(30d左右)、對培養條件(光照、溫度、光周期)和培養設施有一定的要求,而且對操作人員的專業要求高,并不適用于藻類的快速診斷和綠潮災害的及時防治。而且,石莼屬藻類的形態、色澤,以及藻體大小等隨環境變化而呈現出差異; 不同種的石莼屬藻類也會因環境變化呈現出相似的形態特征(Reddyet al,1992; Haydenet al,2003)。這種種內和種間的形態特征的交錯給依賴于形態學特征的物種鑒定和檢測帶來了很大的困難。正是由于基于形態學特征的鑒定方法的不足,直到 2003年根據分子證據,才將原石莼屬和原滸苔屬合二為一,統一為石莼屬(Ulva)(Haydenet al,2003)。日趨嚴重的綠潮災害迫使石莼屬藻類的相關檢測技術向著快速、特異、準確的方向發展。

基于核酸擴增的分子檢測技術具有靈敏度高、特異性好、檢測時間短等優點,其中,以聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)或分子探針技術為主要反應原理的分子技術已應用于藻類物種鑒定,尤其是微藻的快速鑒定和檢測(Coyneet al,2005;Goffrediet al,2006; Yuanet al,2012; Antonellaet al,2013; Dollet al,2014)。但由于這些方法對儀器設備的要求較高,工作環境嚴格,僅限于實驗室診斷。日本學者 Notomi等(2000)研發了一種基于核酸擴增的新型檢測技術——環介導等溫擴增技術(loopmediated isothermal amplification,LAMP),該技術在具鏈置換活性的 Bst DNA聚合酶的作用下,利用6—8條特異性引物,在恒溫條件下可使核酸擴增達到109—1010個數量級(Notomiet al,2000)。LAMP反應可在類似于水浴鍋等恒溫容器中完成,擺脫對于儀器和實驗場地的苛刻要求。但是,LAMP產物的檢測以瓊脂糖凝膠電泳方法或濁度檢測法為主,在此方面仍舊受到凝膠成像系統或濁度儀等設備的限制。而橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)檢測結果可視,若將這兩中技術聯用,可極大程度上降低了檢測過程對儀器的依賴性。LAMP-LFD技術是將LAMP產物進行生物素(biotin)標記,標記產物與異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的特異性探針雜交,雜交結果利用橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)檢測。而且探針的引入可有效避免常規核酸擴增技術(PCR等)引起的污染問題,使得檢測結果更加特異,在生物物種的實驗室診斷和現場檢測領域均體現出較好的應用潛力(Nimitphaket al,2008; Puthamiboolet al,2009; Dinget al,2010;王瑞娜等,2014)。

本研究根據扁滸苔的內轉錄間隔區(ITS1-5.8SITS2)的序列保守區設計 3對引物和1條異硫氰酸熒光素標記的探針,經條件優化后,建立了扁滸苔LAMP-LFD檢測方法。

1 材料與方法

1.1 藻種分離株及培養

實驗所用微藻分離株(塔瑪亞歷山大藻、無紋環溝藻、東海原甲藻、錐狀斯克里普藻、赤潮異彎藻)由寧波大學海洋生物實驗室藻種室提供。實驗所用石莼屬綠藻經由母藻細斷法進行分離(Hiraokaet al,1998),按 Duan等(2012)采用的方法于本實驗室培養、保存。具體所用藻類見表 1,其中,扁滸苔分離株55用于LAMP條件優化、靈敏度分析等實驗。

表1 LAMP-LFD方法建立過程中使用的藻類分離株Tab.1 Algal species used in LAMP-LFD assay

1.2 藻類DNA的制備

各藻類分離株基因組DNA的提取參照植物組織基因組DNA提取試劑盒的步驟進行(Qiagen,Hilden,Germany)。獲取的基因組DNA經Qubit 2.0 Fluorometer(Life Technologies,Carlsbad,USA)測定濃度后用作標準品,–30°C 貯存備用。

1.3 LAMP-LFD引物及探針的設計

針對 NCBI上公布的扁滸苔 ITS1-5.8-ITS2序列(GenBank登錄號: AF013982)設計3對引物,包括上游外引物UcoITS-F3、上游內引物UcoITS-FIP、下游外引物 UcoITS-B3、下游內引物 UcoITS-BIP,以及環引物UcoITS-LF和UcoITS-LB,用于LAMP(表2,圖1)。同時,基于該擴增區段設計1條DNA探針UcoITS-HP用于雜交實驗(表2,圖1)。其中,上游內引物UcoITS-FIP的 5’端進行 biotin標記,UcoITS-HP的 5’端進行 FITC標記。另外,外引物UcoITS-F3和UcoITS-B3作為引物應用于常規PCR擴增,擴增片段大小為333 bp。上述引物和探針由英維捷基(上海)貿易有限公司合成。

表2 扁滸苔ITS1-5.8-ITS2基因的LAMP-LFD引物和探針序列Tab.2 The primers and DNA probe targeting ITS1-5.8S-ITS2 of U. compressa used in LAMP-LFD assay

圖1 扁滸苔rDNA ITS1-5.8S-ITS2基因序列的LAMP-LFD引物設計示意圖Fig.1 Design of primers and DNA probe targeting ITS1-5.8S-ITS2 of U. compressa used in LAMP-LFD assay UcoITS-LFc、UcoITS-B1c、UcoITS-B2c和 UcoITS-B3c分別是UcoITS-LF、UcoITS-B1、UcoITS-B2和UcoITS-B3的互補序列

1.4 LAMP反應條件優化

LAMP的反應體系為 25μL,具體組成參考 Ding等(2010),主要包括20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),6.5 mmol/L MgSO4,10 mmol/L KCl,10 mmol/L(NH4)2SO4,0.1% Triton X-100,1.6 mol/L甜菜堿,1.4 mmol/L dNTPs,外引物UcoITS-F3和UcoITS-B3各0.2μmol/L,內引物 UcoITS-FIP和 UcoITS-BIP各 1.6μmol/L,環引物UcoITS-LF和UcoITS-LB各0.4μmol/L,Bst DNA聚合酶(New England BioLabs,美國)8 U,藻類基因組DNA標準品1μL。陰性對照不加任何DNA。選用扁滸苔分離株55的較高濃度的基因組DNA (1.0×103pg/μL)作為模板,分別在61、63和65°C下進行LAMP反應,根據擴增效果篩選最佳反應溫度。將 DNA標準品已 10倍濃度為單位進行倍比稀釋,選取1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100、1.0×10–1和1.0×10–2pg/μL 等 6個濃度的基因組 DNA 為模板,在確定的最適溫度下進行 LAMP擴增,根據起峰時間和擴增強度分析反應時間; 在此基礎上,選擇最低檢測濃度的基因組DNA為模板分別選擇20、30、40、50、60和70 min作為LAMP反應時間,在最適溫度下擴增,擴增產物經 2%瓊脂糖凝膠電泳分析,確定反應的最適時間。

1.5 利用LFD檢測LAMP產物(LAMP-LFD)

LFD試紙條購買自 Milennia Biotec GmbH(Milenia GenLine HybriDetect by Milenia Biotec GmbH,Germany)。根據該試紙條的設計原理,檢測時FITC標記的探針與biotin標記的LAMP產物特異性雜交,雜交產物與金標記的 FITC抗體結合形成三元復合物,結合在具有 biotin抗體的檢測線上; 未雜交的探針與金標記的 FTIC抗體形成兩元復合物,經過檢測線,結合在質控線上。經biotin標記的LAMP反應結束后,不進行終止反應,而是將20 pmol FITC標記的探針 UcoITS-HP加入反應體系中,63°C雜交 5 min。取5 μL雜交液加入 80 μL Buffer混勻,將試紙條沿正確方向豎直放入該Buffer中反應3 min左右,肉眼判斷結果。

1.6 LAMP-LFD的特異性驗證

選擇扁滸苔(Ulva compressa)分離株 SDF10、曲滸苔(Ulva flexuosa) SDF12、Ulva ohnoiFJ4、緣管滸苔(Ulva linza) HS42、孔石莼(Ulva pertusa) SDF30、滸苔(Ulva prolifera) XS5等常見石莼屬綠藻,以及塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense) NMBjah048、無紋環溝藻(Gyrodinium instriatum) NMBjah046、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense) NMBjah045、錐狀斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea) NMBjah044和赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo) H1等國內常見微藻種類共11株用于LAMP-LFD的特異性檢驗。上述藻類基因組DNA的提取方法按步驟1.2進行,將各基因組DNA的濃度調整到約1.0×103pg/μL后用作LAMP反應的模板,反應體系和條件參考步驟 1.4。擴增產物分別采用瓊脂糖凝膠電泳和LFD進行檢測。

1.7 LAMP-LFD的靈敏度分析

如步驟1.4所述,選取扁滸苔分離株55的6個不同濃度(1.0×103,1.0×102,1.0×101,1.0×100,1.0×10–1和1.0×10–2pg/μL)的基因組 DNA 為模板,采用優化后的反應條件進行LAMP反應,擴增產物分別采用2%瓊脂糖凝膠電泳和LFD進行檢測。

同時,以上述6個不同濃度的基因組DNA為模板,以外引物UcoITS-F3和UcoITS-B3為特異性引物,進行 PCR擴增。PCR的反應體系為 25 μL,包括:10×PCR Buffer 2.50 μL,5 U/μL rTaq DNA 聚合酶(TaKaRa,中國大連)0.25 μL,dNTPs (0.25mmol/L)2μL,0.20 μmol/L gyrB-F3 2 μL,0.20 μmol/L gyrB-B3 2 μL,模板1 μL,用無菌水補足反應體系。PCR反應程序是: 95°C 預變性 2 min 后; 94°C 30 s,55°C 30 s,72°C 30 s,擴增 30 個循環; 72 °C 延伸 10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 LAMP-LFD的重復性實驗

取3份新培養的扁滸苔分離株55,按照步驟1.2的方法進行基因組 DNA的提取,濃度測定后,調整至最低檢測濃度,采用優化后的反應條件進行LAMP反應,擴增產物分別采用瓊脂糖凝膠電泳和 LFD進行檢測。

1.9 野外樣品檢測

共收集海水樣品12份。樣品通過100目的篩絹網過濾后,取400 mL水樣與500 mL的三角燒瓶中,按 Duan等(2012)所述的方法進行培養,培養成熟的藻體用于顯微觀察。另取過濾后的水樣250 mL直接用于基因組DNA的提取,具體方法參考1.2所述,用于LAMP-LFD和PCR鑒定。

2 結果

2.1 LAMP擴增條件的確立

以較高濃度的扁滸苔基因組DNA(1.0×103pg/μL)為模板,分別在61、63和65°C下進行LAMP。3個反應溫度下均可獲得特征性的梯形條帶,而不添加任何DNA模板的反應管中未檢測到擴增(圖2a)。但在 63°C條件下,梯形條帶間的間隔最為分明,條帶最為清晰,故選擇63°C作為最適反應溫度(圖2a)。

在 63°C 條件下,模板濃度在 1.0×103pg/μL 和1.0×100pg/μL之間均可獲得明顯擴增(圖2b),起峰時間維持在27—41 min (圖2c),起峰時間隨模板濃度降低而逐漸增加,呈明顯的線性相關(圖2c),約60 min時,相對熒光強度達到平臺期(圖 2b)。當以較低的1.0×100pg/μL的基因組DNA為模板時,發現反應到50 min時可以檢測到明顯的梯形條帶,而70 min與60 min時的產物濃度并無明顯增加(圖2d),與擴增曲線顯示的結果(圖2c)一致。因此確定60 min為最適反應時間。

2.2 LAMP-LFD檢測的特異性

以 11株常見石莼屬綠藻和微藻的基因組DNA(1.0×103pg/μL)為模板,按優化的 LAMP 反應體系63°C反應60 min。結果表明,滸苔分離株SDF10與55一樣可獲得明顯的擴增(圖3a,3b),而曲滸苔、滸苔、緣管滸苔、孔石莼等石莼屬綠藻的反應呈陰性(圖3a,3b),塔瑪亞歷山大藻、無紋環溝藻、東海原甲藻、錐狀斯克里普藻和赤潮異彎藻等5株微藻的反應亦呈陰性(圖 3a,3b)。LFD檢測結果表明,以兩株扁滸苔分離株的基因組 DNA為模板時,試紙條的檢測線位置出現明顯的陽性條帶,而其它 10株藻類分離株的反應產物在試紙條的檢測線位置未能檢測到條帶(圖 3c)。

2.3 LAMP-LFD檢測的靈敏度

結果表明,LAMP擴增過程中,通過凝膠電泳的方式可檢測到的最低模板濃度是 1.0×100pg/μL(圖4a),而利用 LFD 可檢測到的最低濃度是 1.0×10–1pg/μL (圖 4b)。以外引物 UcoITS-F3 和 UcoITS-B3 為特異性引物的 PCR方法能夠檢測到的最低模板濃度為 1.0×101pg/μL(圖 4c)。

圖2 LAMP檢測扁滸苔最適反應條件的確定Fig.2 The optimization of LAMP for detection of U. compressaa. 確定最佳反應溫度: 1、3和5,以蒸餾水為模板; 2、4和6,以扁滸苔分離株55的較高濃度基因組DNA(1.0×103 pg/μL)為模板; M,GeneRuler 100 bp plus DNA Ladder; 下同。b. 不同濃度的基因組DNA作為模板的LAMP反應; NC,不加任何DNA模板。c. 擴增的起始時間(起峰時間)與基因組DNA濃度的關系,呈明顯額線性相關。d. 以較低濃度(1.0×100 pg/μL)基因組DNA為模板時,擴增時間對LAMP產物的影響; NC,不加任何DNA模板

2.4 LAMP-LFD檢測的重復性

將3份新培養的扁滸苔分離株55的基因組DNA進行倍比稀釋,以1.0×100pg/μL濃度的基因組DNA為模板進行 LAMP反應,產物經瓊脂糖凝膠電泳分析; 以1.0×10–1pg/μL濃度的基因組DNA為模板進行LAMP反應,產物經LFD檢測。實驗表明,利用扁滸苔的基因組DNA為模板進行的LAMP或LAMP-LFD檢測,結果均呈陽性; 而不加任何 DNA為模板的檢測,結果呈陰性,具有良好的重復性。

2.5 LAMP-LFD檢測海水中藻類樣品的適用性分析

利用傳統的藻類分離、培養、顯微觀察的方法對獲得的 12個海水樣品進行了鑒定,發現江蘇的JS-3-1、JS-10和 JS-11為扁滸苔(表 3)。LAMP-LFD的結果表明江蘇的JS-3-1、JS-10和JS-11檢測結果為陽性,其余為陰性,檢測結果與顯微觀察一致(表3)。利用PCR的方法獲得江蘇的JS-3-1、JS-10和JS-11,以及青島的 S19檢測結果均為陽性,其余為陰性(表3)。針對ITS1-5.8S-ITS2區的測序結果表明藻類分離株JS-3-1、JS-10和JS-11為扁滸苔,而青島的S19分離株為滸苔(表3)。

3 討論

石莼屬綠藻作為一類海洋經濟藻類,具有重要的食用和藥用價值(Hiqashi-Okajet al,1999; Ramanet al,2004; Mamathaet al,2007),其可能引發的綠潮災害一直未引起足夠的重視。但是,近年來,由石莼屬綠藻引發的綠潮災害在全球范圍內呈現高發、頻發態勢,給當地生態環境以及海水養殖、旅游等產業產生了巨大影響(Smetaceket al,2013)。2008年,青島附近黃海海域暴發了綠潮災害,近萬人參與了藻體清除工作,花費多達3億美元(Liuet al,2013a),同時給近海的水產養殖造成的直接經濟損失達10億美元(Yeet al,2011)。因此,建立準確、快速的藻類鑒定技術實現對石莼屬綠藻的有效監測、預防和控制具有重要意義。

圖3 LAMP(a、b)和LAMP-LFD(c)的特異性實驗結果Fig.3 Specificity test of LAMP (a,b) and LAMP-LFD (c) for detection of U. compressaUcom1,扁滸苔55; Ucom2,扁滸苔SDF10; Ufle,曲滸苔SDF12;Ulin,緣管滸苔HS42; Uohn,曲滸苔FJ4; Uper,孔石莼SDF30;Upro,滸苔XS5; Atam,塔瑪亞歷山大藻NMBjah048; Gins,無紋環溝藻NMBjah046; Pdon,東海原甲藻NMBjah045; Stro,錐狀斯克里普藻NMBjah044; Haka,赤潮異彎藻H1; NC,不加任何DNA模板

目前,綠潮藻檢測技術的發展還相對滯后,傳統的形態學觀察仍是主要判斷依據。石莼屬種類多,形態特征復雜且易隨環境改變而變化,形態學觀察的方法常常使得石莼屬藻類的鑒定出現混亂或難以判斷(Blomsteret al,1998; Maltaet al,1999),這就要求檢測人員必須具備較強的專業知識,即便如此,在實際操作中,也經常出現結果的誤判。借助分子生物學的方法進行綠潮藻類的鑒定仍處于起步階段。基于ITS、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因(rbcL)等基因序列的系統進化分析較早應用于石莼屬藻類的種屬鑒定(Blomsteret al,1998; Coatet al,1998),作為傳統形態學觀察的一種輔助手段,在藻類鑒定方面取得了較好的應用效果(Liuet al,2010; Wanget al,2010;Duanet al,2012)。Xiao等(2013)基于ITS建立了限制性片段長度多態性(RFLP)的分析方法,結合 5S rDNA間隔區的PCR擴增技術,成功地應用于黃海海域常見石莼屬和盤苔屬藻類的種類鑒定。盡管如此,這些方法均未對自身的檢測靈敏度等指標進行描述。段維軍等(2012)通過比較分析石莼屬不同種類的 ITS序列,建立了可特異性檢測扁滸苔的PCR方法,最低可檢測到10 pg的扁滸苔基因組DNA。Zhang等(2014)以滸苔的5S rDNA間隔區為靶標建立了熒光原位雜交技術(FISH),利用該技術不僅可將滸苔與緣管滸苔、曲滸苔、扁滸苔、孔石莼,以及盤苔屬藻類區分開來,同時也能對滸苔完成定量分析。本研究建立的LAMP-LFD技術,能夠將扁滸苔與滸苔、曲滸苔、緣管滸苔和孔石莼等石莼屬區分開來,而且針對塔瑪亞歷山大藻、無紋環溝藻、東海原甲藻、錐狀斯克里普藻和赤潮異彎藻等引發赤潮的常見藻類也表現出良好的特異性。利用該 LAMP-LFD方法,最低可檢測到 0.1 pg的扁滸苔基因組 DNA,是以 UcoITS-F3和UcoITS-B3為特異性引物的PCR方法的100倍。12個的野外樣本檢測結果顯示,LAMP-LFD技術的檢測結果與傳統的形態學觀察、PCR方法取得的結果基本一致,表明該方法有潛力成為我國沿海扁滸苔快速檢測的有效技術手段之一并加以推廣。

圖4 LAMP(a)、LAMP-LFD(b)和PCR(c)檢測扁滸苔的靈敏度比較Fig.4 Comparison in detection limit to U. Compressa by LAMP(a),LAMP-LFD (b),and PCR (c)NC: 不加任何DNA模板。LAMP-LFD檢測到的最低模板濃度為1.0×10–1 pg/μL; LAMP為1.0×100 pg/μL; PCR方法為1.0×101 pg/μL

圖5 LAMP(a)和LAMP-LFD(b)的重復性實驗Fig.5 Reproducibility of LAMP-LFD(a) and LAMP (b) for detection of U. compressaa. 以扁滸苔1.0×100 pg/μL濃度的基因組DNA為模板; NC,不加任何DNA模板。b. 以扁滸苔1.0×10–1 pg/μL濃度的基因組DNA為模板; NC,不加任何DNA模板

表3 利用顯微觀察、LAMP-LFD以及PCR方法對海水樣品中扁滸苔的檢測結果Tab.3 Detection of U. compressa from field samples by microscopic examination,LAMP-LFD,and PCR

基于 PCR或核酸雜交的檢測技術能夠適用于多數生物樣本的檢測,尤其適用于設備齊全的實驗室診斷領域。實時、便捷是分子生物學技術的重要指標,也是決定其能廣泛應用于各領域現場檢測的主要因素。目前針對石莼屬藻類的檢測技術均體現出一定的適用性,但作為一種快檢技術應用于藻類的現場檢測仍存在明顯的不適性。依賴于核酸測序的系統進化分析與傳統的形態學觀察結合后能夠準確的確定藻類物種(Liuet al,2010; Wanget al,2010; Duanet al,2012),但該方法依賴于 PCR技術,序列測定受制于相關公司,而且該方法需工作人員具備專業的系統進化知識,諸多限制使得本方法多在石莼屬藻類基礎性研究的實驗室使用。RFLP和常規PCR技術能夠快速完成石莼屬藻類的實驗室診斷(Duanet al,2012;Xiaoet al,2013),但需依賴于PCR儀、凝膠成像系統等儀器設備。本研究建立的LAMP-LFD技術在核酸擴增階段擺脫了對 PCR儀等昂貴儀器的依賴,在檢測階段也不再需要凝膠成像系統或濁度儀等設備,整個檢測完全可在室外完成; 而且特異性探針的引入也可避免熒光染料法造成的假陽性問題(Schnetzingeret al,2013)。同時,本研究建立的LAMP-LFD方法能夠在 60 min內實現核酸的幾何級數擴增,完成整個檢測也僅需要不到70 min。因此,本研究建立的 LAMP-LFD方法作為一種快檢技術,可作為扁滸苔現場檢測的重要工具并加以推廣。

4 結論

本研究根據扁滸苔的 ITS1-5.8S-ITS2基因序列建立的LAMP-LFD方法可特異性檢測扁滸苔。該方法檢測靈敏度高,最低可檢測到0.1 pg的扁滸苔基因組DNA; 檢測時間短,從LAMP擴增到LFD結果判讀僅需70 min,且無需對待檢樣品進行培養、分離。該技術擺脫了對實驗室環境和儀器設備的依賴,對操作人員的技能要求較低,作為一種新型快檢技術,有潛力成為扁滸苔現場檢測的重要手段。

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