長牡蠣(Crassostrea gigas)鮮樣組織八種成分含量近紅外(NIR)模型的建立*

王衛軍 楊建敏① 董迎輝 臧恒昌 王中平 孫國華

(1. 山東省海洋資源與環境研究院 山東省海洋生態修復重點實驗室 煙臺 264006; 2. 浙江萬里學院生物與環境學院 寧波315100; 3. 山東大學藥學院 國家糖工程技術研究中心 濟南 250012; 4. 崆峒島實業有限公司 煙臺 264000)

近紅外(Near Infrared,NIR)技術是一種對有機物成分含量快速分析的新型分析技術,它可以同時檢測出樣品中的多種成分參數。與傳統的化學檢測方法相比,NIR技術具有高通量、省時、省力、低成本以及環保無污染的特點(Osborneet al,1993)。NIR技術是研究動物肉質性狀成分指標的高效方法,在選擇育種和成分含量快速檢測方面應用廣泛。Zamora-Rojas等(2011)將 NIR技術應用于西班牙伊比利亞豬肉質性狀的選育(Iberian Pig Breeding,IPB),由于每年需要對大量候選個體的多項指標進行分析檢測,NIR技術的使用使得檢測時間和成本大大降低。Zome?o等(2012)通過建立 NIR模型,快速分析了選育系143個家兔的肌間脂肪酸的變化,大大提高了實驗效率。Folkestad等(2008)建立了大西洋鮭肉質中脂肪和色素含量的分析模型,解決了鮭魚肉質分析過程中兩個指標的同時、快速和無損傷檢測的難題。Fluckiger等(2011)建立了鮑活體、新鮮樣組織和冷凍干燥腹足肌樣品的糖原含量快速檢測模型,并成功進行了預測分析。Wu等(2013)運用NIR技術檢測鮭魚肉質的保水能力,化學真實值與光譜預測值的相關系數到達0.941,準確度非常高。NIR技術的應用,大大提高了肉質性狀成分的分析效率,并顯著的降低了檢測成本。

長牡蠣(Crassostrea gigas)又稱太平洋牡蠣,具有環境適應性強、生長迅速、營養豐富等優點,是產量最高的世界廣布性大宗經濟貝類。2013年我國牡蠣總產量達 421.9萬 t (農業部漁業漁政管理局,2014),為人們提供了豐富的蛋白源。牡蠣不同的風味和營養品質影響著消費者的消費傾向,進而決定著其商品價值。隨著生活水平的不斷提高,人們對于牡蠣的消費,更加注重肉質的風味和營養,而牡蠣的肉質性狀是決定其口感和營養品質的重要經濟性狀,選育口感佳、營養好的新品種是牡蠣高端市場的迫切需求。目前,對于長牡蠣育種方面的研究主要集中在利用雜種優勢進行種間雜交(張躍環等,2014),殼色新品系的選育(叢日浩等,2014)和群體選育快速生長新品系(王慶志等,2013)方面,有關牡蠣肉質性狀新品系選育的工作在國內外均未見報道。究其原因,是因為對肉質性狀進行新品種選育時需要對大量候選個體進行多個營養指標的分析,傳統的化學檢測方法具有耗時長、效率低、檢測成本高的缺點。因而,建立快速高效的肉質性狀分析模型是開展牡蠣肉質性狀新品系選育的基礎。本研究測定了長牡蠣8種成分含量,并運用NIR技術建立了分析預測模型; 研究結果對開展大規模長牡蠣多種成分含量,選育肉質性狀長牡蠣新品系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

傅里葉變換 NIR光譜儀(Antaris MX,USA),配備 RESULTTM樣本光譜采集的集成軟件以及數據處理軟件 TQ analyst (Thermo Fisher,USA),酶標儀(BIO-RAD,USA)、原子熒光光譜儀(PA-10)和微波消解系統(Mars Xpress,USA)、高效液相色譜儀(Waters Inc.,USA)、火焰原子吸收分光光度計(AA-800,USA)、自動凱氏定氮儀(FOSS kjeltecTM2300,Sweden)、索氏提取器、馬福爐和大型真空冷凍干燥機(ZDGX5),勻漿機(IKA?T18 basic ULTRA-TURRAX?,Germany)。

1.2 樣本采集

本實驗在2012年11月—2013年8月期間,分別從山東乳山、芝罘島、崆峒島和劉公島,遼寧東港和小山島,江蘇贛榆等長牡蠣主產區的7個地點,采集了54批野生和養殖的長牡蠣樣品共計94份,樣品鮮軟體部肉重(不包含閉殼肌)為 0.51—44.69g,樣品包含了0.5齡貝、1.5齡貝和2.5齡貝。在不能辨別雌雄的季節,將同批樣品依據大個體和小個體分為兩組,作為極大值樣本組和極小值樣本組; 在2013年 5—7月,根據雌雄不同,將同批樣品分為雌雄樣本組。

1.3 樣品前處理

將長牡蠣進行解剖,取軟體組織,每份樣本20—60g,放置在50mL的冷凍離心管中。首先用剪刀將軟組織剪碎,再用勻漿機在最大轉速勻漿30—50s,勻漿過程中,將離心管置于冰盒中。將勻漿好的樣本分為兩部分: 一部分用于NIR光譜采集,另一部分用于8種成分含量的化學測定分析。

1.4 近紅外光譜采集

光譜掃描前,應用RESULT集成軟件編定樣品光譜采集的工作流程,并使光譜儀開機預熱至少0.5 h。在直徑 1cm的石英杯中加入高度為 1.5cm勻漿好的樣本。采用漫反射光譜,光譜掃描波數范圍 10000—4000 cm–1,掃描次數為 32次,分辨率為 8 cm–1,用log(1/R)漫反射方法表示吸收光譜。測量時環境溫度為20 °C,相對濕度為10 %。每次采集樣品前采集背景光譜來消除背景的影響,測量時間小于1 min。

1.5 化學真實值測定

在山東省海洋資源與環境研究院中心實驗室對94份樣本的 8種成分含量的化學真實值的進行了測定。總蛋白質、總脂肪、鋅和硒和灰分含量的測定,依據行業標準進行(中華人民共和國衛生部,2010a,b;中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫局等,2008a,b,c); 牛磺酸含量的測定參考陳申如等(2013); 糖原含量測定使用 EnzyChromTM糖原試劑盒(BioAssay Systems,USA)。

1.6 模型建立和驗證

利用TQ Analyst (version 9.1.17,USA)軟件處理采集的光譜數據,選用偏最小二乘法(Partial Least Squares,PLC)作為建立定標模型的化學計量方法,選擇軟件自動推薦的光譜范圍,并對模型進行優化和檢驗,篩選最佳的光譜預處理方法,以確保獲得數理指標最理想的數學模型。

通過交叉驗證的方法來對模型進行內部驗證,即: 每次從校正樣品集中取出1個樣品作為臨時驗證樣品,以其余的樣品進行建模,然后對這1個樣品進行預測,如此循壞,則會分別得到所有樣品的交叉預測值。而外部驗證則是重新收集一批標準樣品用作驗證樣品。內部驗證和外部驗證的預測值對比分析從而得到模型的參考值。主要通過比較預測值與化學分析值的相關系數(R)、交互驗證殘差均方根(Root mean square error of cross-validation,RMSECV)、預測殘差均方根(Root mean square error of external prediction,RMSEP)和 RPD(驗證用樣本真實值的標準差(SD)與RMSECV或者 RMSEP的比值,即 RPDCV=SD/RMSECV 或者 RPDEV=SD/RMSEP)等指標來衡量定標模型的準確性。由于光譜儀的系統誤差、光譜信號的漂移等原因,所測得樣品的NIR可能出現異常,使得模型預測精度下降(陳雪英等,2009),本實驗采用TQTMAnalyst軟件中馬氏距離來判別異常點,進行樣本異常值的剔除。本實驗中94份樣品的建模集和驗證集的樣本數見表1。

表1 長牡蠣鮮樣組織建模集和驗證集樣本8種成分含量Tab.1 Composition of the calibration and validation set of flesh tissue samples as determined by chemical reference methods

2 結果

2.1 長牡蠣鮮樣組織8種成分含量指標描述性統計

本實驗在我國多個長牡蠣產地選取不同發育階段、不同養殖方式和不同年齡的 94份樣品,超過Windham等(1989)所提出的最低樣本數為 50份的要求。表1為8種不同成分建模集和驗證集樣本的數目和化學真實值的分析結果。實驗中分析的各種成分含量范圍較大,含量最大值與最小值的比值分別為: 水分(1.23),糖原(80.63),總蛋白質(3.20),總脂肪(33.74),牛磺酸(3.28),鋅(5.55),硒(4.97)和灰分(2.51),符合近紅外分析模型建立過程中對樣品含量分布范圍廣的要求。

2.2 光譜數據預處理

長牡蠣鮮樣組織樣本的 NIR漫反射原始光譜如圖1所示。建模過程中對不同成分的光譜數據進行不同的平滑處理,最終選擇適合各自成分模型的最佳參數組合(圖 2)。根據篩選出的最佳參數組合,確定長牡蠣鮮樣組織水分、糖原、總蛋白質、總脂肪、牛磺酸、鋅、硒、灰分的預測模型。各成分含量模型所用的光譜范圍、光譜處理方法以及建模用的主因子數等主要參數見表2。

2.3 模型建立及優化

圖1 長牡蠣鮮樣組織所有樣本的NIR漫反射原始光譜Fig.1 Original NIR spectra of all flesh samples of Pacific oyster C. gigas

根據 TQ Analyst軟件的異常值推薦,不同成分含量樣本異常值的剔除數見表3。樣本各成分含量建模的結果中,水分、糖原和總蛋白質含量的相關系數(RC)較高,均大于0.96,其RMSEC值均較小(圖3a,b,c); 交叉驗證相關系數(RCV)和外部驗證的相關系數(REV)較高,均大于0.93,其RMSECV值和RMSEP值也較小; 模型驗證的重要參數 RPD值變化范圍為2.80—7.04 (表3),說明水分、糖原和總蛋白質含量的模型精確度高,可用于長牡蠣鮮樣組織的成分預測。另一方面,總脂肪、牛磺酸、鋅、硒、灰分含量5個成分,建模過程中的RC值和RMSEC值等參數均不理想(圖 3d); 交叉驗證和外部驗證的相關系數(RCV和REV)均低于0.85,RPD值除Zn含量以外都低于2.5(表3)。綜合考慮多個衡量指標,總脂肪、牛磺酸、鋅、硒、灰分5個成分含量的NIR模型不適合于長牡蠣鮮肉組織的精確定量分析。

圖2 長牡蠣鮮樣組織糖原含量樣本NIR光譜一階求導處理Fig.2 Glycogen content of NIR treatment with first derivative of flesh tissue samples of Pacific oyster C. gigas

表2 長牡蠣成分含量建模集和驗證集光譜數據處理參數Tab.2 Parameters of the calibration and validation sets for chemical composition in Pacific oyster C. gigas

3 討論

3.1 鮮樣本模型與干樣本模型的比較

本實驗在建立長牡蠣鮮樣組織NIR模型的同時,建立了長牡蠣冷凍干燥樣本的 NIR模型,鮮樣組織(漿狀)和干樣(粉末)樣品兩種不同處理形態的建模效果存在差異。其中,粉末樣品模型結果顯示,糖原和總蛋白質含量模型可以精確的預測未知樣本的含量,總脂肪、鋅、硒、灰分含量可準確的預測未知樣本的含量,只有牛磺酸含量模型的預測效果不好(未發表數據)。長牡蠣鮮樣組織和干樣樣品兩個實驗結果中,糖原和總蛋白質含量建模效果一致,均可以精確的預測未知樣品; 牛磺酸含量模型在兩個實驗中均不能準確的預測未知樣品; 而鮮樣組織的脂肪、鋅、硒和灰分含量的模型卻不能準確預測。Viljoen等(2005,2007)在對鴕鳥肉和羊肉鮮樣組織和冷凍干燥樣品研究過程中發現,冷凍干燥樣品模型的預測效果更好。對冷凍干燥樣品進行光譜分析時,樣品溫度變化不明顯; 而且冷凍干燥樣品可以避免在紅外光譜區域的非常高的吸收峰(Murrayet al,1987),這些噪音可能降低模型預測的準確性(Pedersenet al,2003)。由于長牡蠣鮮樣組織中水分含量高(約 80%),導致光譜采集過程中溫度變化的不確定性,這可能是導致建模不成功的主要原因。

圖3 建模過程中水分、糖原、總蛋白質和牛磺酸含量NIR主要參數Fig.3 NIR parameters of moisture,glycogen,protein and taurine content in the process of modelinga、b、c為精確度高的長牡蠣水分、糖原和總蛋白質含量NIR模型的參數指標; d為精確度低的NIR模型的參數指標(以牛磺酸含量為例)

3.2 模型建立過程中的主要參數標準

在構建的模型中,建模相關系數(RC)、交互驗證相關系數(RCV)和外部驗證相關系數(REV)值越接近 1模型的預測效果越好,在本實驗中,各個相關系數都在0.93以上,最高值是0.99,說明模型的精確度非常高。同時模型的 RPD值是衡量模型是否準確的另一個重要指標,好的模型具有高的RPD值。當RPD值大于 2.5時模型可以進行準確預測(Guyet al,2011;Zhouet al,2012)。在本實驗中雖然鋅含量預測模型的RPD值超過 10,但不論是其RC值、RCV值還是REV值均小于0.52,綜合考慮各個指標,鋅含量的NIR模型不具備準確預測的能力。

牛磺酸是一種游離氨基酸,屬于有機物,理論上通過建立 NIR模型,可以準確的預測未知樣本的含量。但是本實驗中牛磺酸含量模型預測效果差,分析原因可能是牛磺酸化學真實值的SD值小(Zhouet al,2012),變動范圍窄(Prietoet al,2009)所致。

3.3 模型建立對肉質性狀選育的意義

本實驗結果將用于長牡蠣肉質性狀選育、育種世代的鑒定及種質資源評價等研究。以上這些方面的研究需要對成千上萬個個體、多個指標進行成分含量的分析,因此常規的化學分析方法難以快捷、高效批量的完成這些分析工作。課題組將運用本實驗結果對構建的長牡蠣家系進行成分含量分析,進行遺傳參數估計和育種值估計,將為開展肉質性狀選育奠定基礎。

4 結論

NIR技術可以快速精確地測定長牡蠣鮮肉組織(漿狀)中的水分、糖原和總蛋白質 3種成分含量,但是對總脂肪、鋅、硒、牛磺酸和灰分含量不能準確測量。本研究中建立的以上3種成分含量NIR模型,可快速、準確、無環境污染地對長牡蠣肉質進行分析,并對肉質性狀選育及育種世代的鑒定和種質資源評價都有非常重要的意義。

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