日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)組蛋白酶B基因克隆及其在組織和卵巢發育過程中的表達*

趙衛紅 陳立僑① 王資生 張鳳英, 齊志濤

(1. 鹽城工學院海洋與生物工程學院 鹽城 224051; 2. 華東師范大學生命科學學院 上海 200062;3. 中國水產科學研究院東海水產研究所 上海 200090)

溶酶體半胱氨酸組蛋白酶具有廣譜的蛋白水解活性,能水解多種動物蛋白和植物蛋白(盧士英等,2004)。人體內目前發現了 11種半胱氨酸組蛋白酶:組蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、X和W(Turket al,2012)。由于組蛋白酶B(CB)和組蛋白酶L(CL)與哺乳動物和人類癌細胞轉移過程有關,因此備受關注。CB和 CL能直接溶解或者間接激活細胞外基質如膠原蛋白、層粘連蛋白、基底膜等成分的溶解,從而促進腫瘤細胞向深部組織浸潤,為癌細胞的轉移打開通道(盧士英等,2004)。CB和CL在魚類卵黃蛋白的水解過程中的作用亦得到廣泛的研究與認可(Sireet al,1994; Carnevaliet al,1999; LaFleuret al,2005; Carnevaliet al,2006)。甲殼動物等節肢動物的卵子與魚類卵子一樣,含有大量的卵黃蛋白,該蛋白在酶的水解作用后方可為后續胚胎的發育提供營養。越來越多的研究報道表明CB和CL同樣參與節肢動物卵黃蛋白的水解,如桑蠶Bombyx mori(Kageyamaet al,1990)和軟蜱Orithodors moubata(Fagotto,1990a,b)卵巢中發現了對卵黃蛋白具有水解作用的CL類似蛋白的存在,同樣蚊子Aedes aegypti體內的CB類似蛋白酶亦參與卵黃蛋白的降解(Choet al,1999)。有關經濟蝦類CL基因克隆及其表達研究報道較多。目前CL及其類似物cDNA全長已經從美國龍蝦Homarus americanus(Laycocket al,1992)、挪威龍蝦Nephropsnorvegicus(Le Boulayet al,1995)、凡納濱對蝦Penaeus vannamei(Le Boulayet al,1996)、刀額新對蝦Metapenaeus ensis(Huet al,2004)、鹽水蝦Artemia franciscana(Warneret al,2004)和日本沼蝦Macrobrachium nipponense(Zhaoet al,2013)體內分離獲得。但是經濟蝦類 CB基因目前僅有北極甜蝦Pandalus borealis(Aokiet al,2003)和斑節對蝦Penaeus monodon(EF213113.1,未發表)的相關報道。日本沼蝦(M. nipponense)肉味鮮嫩,營養豐富,分布廣泛,是我國重要的經濟淡水養殖蝦。本研究首次克隆了日本沼蝦CB(MnCB)基因cDNA全長,并分析其蛋白結構,尋找其活性位點,預測其具有催化活性的結構; 并對其蛋白序列進行同源性和系統進化樹的分析,顯示MnCB序列和其它物種的關系; 采用熒光定量 PCR(qPCR)的方法測定其在各組織及卵巢發育過程中的表達量,初步探討其在日本沼蝦體內的作用及與卵巢發育的關系,為日本沼蝦體內該基因的功能研究提供一些基礎知識。

1 材料與方法

1.1 組織取樣

日本沼蝦(1.3—2.1 g)購自上海市銅川路水產市場。試驗蝦從市場購回后,于實驗室水族箱中充氣暫養一周后解剖,分別取卵巢、肝胰腺、鰓、肌肉、胸神經節、心臟、腸和血細胞等組織和細胞液氮中速凍,–80°C保存用于后續 RNA抽提。其中卵巢不同發育階段分別取樣,其它組織均取自卵巢發育Ⅱ期的雌蝦。每個組織均取8—12尾蝦。卵巢發育分期采用6期法(Wuet al,2009)。

1.2 RNA的抽提和cDNA的反轉

RNA采用Unizol試劑按照試劑說明書抽提。取抽提獲得的1μLRNA用于凝膠電泳,檢測RNA的完整性。取 1μLRNA進行紫外分光光度測定 OD260/OD280比值,檢測 RNA 純度。取 0.5μg RNA 采用cDNA TaKaRa PrimerScriptTM第一鏈cDNA合成試劑盒(大連寶生物)合成cDNA。

1.3 采用3′RACE和5′RACE獲得基因全長

用于5′RACE和3'RACE的cDNA分別采用Smart Race試劑盒(Clontech,Palo Alto,CA,USA)和3′-RACE 合成試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)按照說明書操作步驟合成。引物AP、AUAP、5′-CDS primer A、SMART II A Oligonucleotide和UPM均由RACE試劑盒提供。3′RACE和5’RACE特異性引物均按照日本沼蝦卵巢 EST文庫中 MnCB片段采用primer 5.0軟件設計獲得。MnCB 3'RACE特異性引物3'MnCBP1,3'RACE巢式引物 3'MnCBP2。根據上述獲得的3'端片斷設定引物3’MnCBP3作為3'RACE特異性引物進行新了一輪3'RACE擴增,獲得MnCB的polyA 尾巴。MnCB 5'-RACE特異性引物為5'MnCBP1。上述所有特異性引物的序列及其Tm值見表1。

表1 引物序列及其Tm值Tab.1 Sequences of primers and their Tm

1.4 基因全長的分子生物學信息分析

核酸和蛋白序列相似性比較采用 NCBI BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析,蛋白特性分析采用專業蛋白分析系統 Expert Protein Analysis System (http://www.expasy.org/),信號肽和結構域分析分別采用 SignalP 3.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/)和結構域掃描程序 Motif scan program (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)分析,同源性分析采用 ClusterW 多序列比較軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)和 Boxshade軟件(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)進行陰影分析,系統進化樹采用Mega軟件包中的鄰接法(NJ)構建。用于陰影分析和系統進化樹構建的基因序列號見表2。

1.5 實時熒光定量PCR(qPCR)

MnCB qPCR引物序列為 qCBF和 qCBR(表 1),內參基因為 β-actin,引物序列來自文獻(Zhaoet al,2011)。qPCR反應體系: SYBR Premix Ex Taq (2×) 10.0 μL,ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL,cDNA 2.0 μL,10 μmol/L 的引物各 0.4 μL,ddH20 6.8 μL。反應程序:95°C 預變性 1 min,95°C 變性 5 s,60°C 退火 40 s,40個循環。

1.6 數據分析

MnCB和β-actin的表達量采用標準曲線法計算。標準曲線的制備: 將已知濃度的cDNA稀釋成不同濃度(10–1、10–2、10–3、10–4和 10–5),測定不同濃度 cDNA的 CT值,橫坐標為 cDNA濃度對數,縱坐標為 CT值作圖,獲得cDNA濃度對數與CT值之間的標準曲線。將未知樣品的CT值代入標準曲線,計算出樣品的cDNA濃度。MnCB的相對表達量采用MnCB和β-actin表達量的比值表示,最終表示為平均值±標準差(Mean±SD)表示,采用One-way ANOVA對日本沼蝦各組織中 MnCB基因表達量進行統計分析,用Duncan氏多重比較法分析組間差異顯著程度,顯著水平為P＜0.05。

表2 用于MnCB同源比對的分析和構建系統進化樹的物種名及其登錄號Tab.2 Accession numbers,scientific name,and source of the members of cathepsin B amino sequences used to homologues alignment and construct the phylogenetic tree

2 結果

2.1 MnCB基因cDNA序列結構分析

3’RACE和 5’RACE測序結果通過 Bioedit軟件拼接后獲得全長為1643 bp的MnCB,cDNA序列和推導的氨基酸序列見圖1。該序列含有12 bp的5’-UTR,996 bp 的ORF 和 702bp 的3’-UTR(序列號: HM134079)。ORF區共編碼331個氨基酸,此多肽包含16個氨基酸組成的信號肽、63氨基酸組成的前導肽和 252個氨基酸組成的成熟肽三個部分,其理論pI為6.36,分子量為36.5 kDa。

2.2 MnCB cDNA序列與其它物種組蛋白酶B的比較分析

經多重比較后發現,MnCB與其它不同甲殼動物組蛋白酶B(CB)一樣都存在一些保守的結構域(圖2),且一般位于非信號肽序列部分。系統進化樹的分析結果(圖3)顯示: 牙鲆Paralichthys olivaceus、大西洋庸鰈Hippoglossus hippoglossus、斑馬魚Danio rerio和鮭魚Salmo salar四種魚類聚在一起,同為甲殼類的北極甜蝦、斑節對蝦和日本沼蝦聚成一支,軟體動物的文蛤Meretrix meretrix和環節動物的日本血吸蟲Schistosoma japonicum分別自成一支。

2.3 MnCB組織表達特性

內標基因 β-actin在各組織的表達量較一致,MnCB基因在測定的各組織中也均有表達,其中在心臟中表達量最高,肌肉、肝胰腺和胸神經節中表達量中等,腸、鰓和血細胞中的表達量較低(圖4)。

2.4 卵巢發育過程中MnCB基因的表達

不同發育階段卵巢中 MnCB基因表達變化過程見圖 5。在卵巢的發育過程中,MnCB的表達量先增后降。從卵原細胞增殖期(Ⅰ期)發育至卵黃發生前期(Ⅱ期),MnCB表達量顯著增加,增至Ⅰ期2倍左右,至初級卵黃發生期(Ⅲ期)MnCB的表達量急劇增加,分別為Ⅱ期和Ⅰ期表達量的5倍和 10倍左右,差異顯著(P＜0.05),次級卵黃發生期(Ⅳ期)表達量繼續增加,但是Ⅳ期和Ⅲ期的表達量差異不顯著(P＞0.05),成熟期(V期)下降。產卵后(VI期)、V期和Ⅱ期兩兩差異均不顯著(P＞0.05)。

3 討論

多重比較結果顯示CB蛋白在進化過程中保守性較強,且這些保守序列主要位于非信號肽部位。通過CB保守序列建立的N-J系統樹顯示幾種魚類聚為一支、幾種甲殼類聚為一支,該結果和傳統的分類結果一致。

MnCB氨基酸序列中具有4個活性位點: Gln143、Cys149、Asn288和 His309。CB 屬于 C1 家族多肽酶,該家族酶的催化殘基為Cys 和 His形成的二聚體。另外朝向His咪唑環的Asn和位于Cys殘基前面的Gln在催化過程中也起非常重要的作用,Gln具有幫助Cys殘基在催化過程中形成氧陰離子洞的作用。另外MnCB氨基酸序列中具有6個S2亞位點: Phe152、Pro153、Ala170、Gly274、Ala277 和 Glu322。S2 亞位點是木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶的口袋結構,這一結構有利于與大疏水殘基或芳香殘基結合,而且CB基因口袋結構的底部還具有可以與 Arg結合的Glu。

文獻報道顯示組蛋白酶通常由 16—18個氨基酸的信號肽、62—100個氨基酸的前導肽和 220—230個氨基酸的成熟肽組成(Bertiet al,1995; Lecailleet al,2002)。本研究克隆得到的MnCB亦由信號肽、前導肽和成熟肽三個部分組成,其氨基酸數目分別為16、63和252,信號肽和前導肽的數量介于上述報道范圍之內,成熟肽超過上述范圍。這一結果與北極甜蝦P.borealis中的報道一致,北極甜蝦組 CB的成熟肽為253個氨基酸(Aokiet al,2003)。組蛋白酶合成之初沒有活性,以酶原的形式存在,隨著 pH 值的改變,溶酶體減弱前導肽和催化位點之間的連接,改變酶原的構象,使之變成具有活性的酶,H+-ATP酶使卵巢中pH值降低,促進酶原的激活(Fagotto,1995; Kwonet al,2001; Selmanet al,2001; Turket al,2001;Raldúaet al,2006)。

圖2 MnCB序列與其它物種組蛋白酶B序列的多重比較Fig.2 Alignment of MnCB with other aquatic organisms homologues陰影部分表示相同的序列,灰色表示保守但不完全相同的序列,空心箭頭為活性位點,實心箭頭為S2亞位點

本研究測定日本沼蝦 MnCB廣泛存在于各組織中,其中心臟中表達量最高,胸神經節、肝胰腺和肌肉中的表達量均較高。MnCB在心臟和肌肉中的高表達可能與CB 能降解肌球蛋白、肌鈣蛋白、原肌蛋白和肌動蛋白的作用有關(陳磊等,2008)。肝胰腺在甲殼動物體內扮演著極其重要的角色,不僅具有消化吸收的作用,而且具有重要的免疫功能,另外日本沼蝦肝胰腺還是卵巢發育的重要營養來源(Zhaoet al,2013)。所以肝胰腺中MnCB高表達可能與CB兼有胞內消化和抗原加工的功能有關(盧士英等,2004)。肝胰腺中CB高表達在北極甜蝦中也有類似的研究報道(Aokiet al,2003)。另外,同樣具有胞內消化作用的CL在美洲龍蝦(Laycocket al,1992)和挪威龍蝦(Le Boulayet al,1995)肝胰腺中亦高度表達。甲殼動物的胸神經節是重要的神經內分泌器官,可以分泌 GSH等性腺刺激激素從而促進卵巢發育(穆淑梅等,2004),而CB具有激素活化的作用(盧士英等,2004),所以日本沼蝦胸神經節中MnCB的高表達可能與MnCB活躍激素分泌的功能有關。

圖3 MnCB與其它物種的組蛋白酶B的N-J系統發育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of MnCB amino acid sequences from other animals

圖4 日本沼蝦不同組織中MnCB基因的相對表達量Fig.4 Relative expression level of MnCB mRNA in different tissues of M. nipponense圖中字母相同表示表達量差異不顯著(P＞0.05),不相同表示表達量差異顯著(P＜0.05),下同

圖5 日本沼蝦卵巢不同發育階段MnCB mRNA的相對表達量Fig.5 Temporal expression profile of the MnCB transcript in the ovary of M. nipponense during ovarian development柱狀圖上字母相同表示差異不顯著(P＞0.05),不同表示差異顯著(P＜0.05)

甲殼動物的卵黃蛋白原(Vg)按照合成來源可以分為內源性和外源性。卵巢自身合成的為內源性,卵巢以外的組織,如肝胰腺、脂肪體或濾泡細胞中合成的為外源性。外源合成的 Vg,通過血液循環運送至卵母細胞,通過膜受體結合后進入卵母細胞中(張士璀等,2002)。Vg在卵母細胞的成熟過程中被分解為脂磷蛋白、高磷蛋白和β’組分等卵黃蛋白(Vn),儲存于卵黃顆粒中,Vn進一步水解為氨基酸為胚胎發育提供營養(Finn,2007)。Vg水解為Vn進而水解為氨基酸均需要水解酶的參與。有研究表明CB和CL在甲殼動物該水解過程中發揮著重要的作用(Fagotto,1990a,b; Kageyamaet al,1990; Choet al,1999)。本試驗qPCR測定結果顯示日本沼蝦卵巢中MnCB的表達量與卵巢的發育程度有關,隨著卵巢的發育,MnCB表達量逐漸增加,卵巢發育至初級卵黃發生期表達量急劇增加,次級卵黃發生期表達量繼續增加,并達到最大值,成熟期下降。這表明MnCB與日本沼蝦的Vg或者Vn的水解有關。有研究表明組蛋白酶D(CD)和CB蛋白活性在海鯛Sparus aurata卵黃發生早期最高,且進一步的研究表明CD可以水解Vg,而CB對Vg沒有水解作用,另外CL在卵黃發生后期活性最高,為Vn的水解酶(Carnevaliet al,1999)。本課題組發現日本沼蝦組蛋白酶 L(MnCL)在卵巢發育至次級卵黃發生期,表達量急劇增加并達到最大值(Zhaoet al,2013),也就是說,在卵巢發育過程中 MnCB基因表達量增加比 MnCL早,這和海鯛的研究結果一致(Carnevaliet al,1999)。斑馬魚中CB不僅可以直接水解 Vn,而且還可以激活 CL的活性,促進 CL對 Vn進行水解(Carnevaliet al,2006)。日本沼蝦卵巢發育至Ⅲ期MnCB基因表達急劇增加,Ⅳ期MnCL基因急劇增加,這種先后關系也許暗示著MnCB和MnCL之間的某種關聯,也許如斑馬魚中MnCB可以激活MnCL的活性具有某種的激活作用。

盧士英,任洪林,柳增善等,2004. 組織蛋白酶 B研究進展.河北師范大學學報(自然科學版),28(3): 306—309

張士璀,孫旭彤,李紅巖,2002. 卵黃蛋白原研究及其進展.海洋科學,26(7): 32—35

陳 磊,李學偉,朱 礪等,2008. 豬Cathepsin B基因cDNA分子克隆、序列分析及遺傳多態性分析. 畜牧獸醫學報,39(4): 385—392

穆淑梅,康現江,牛建章等,2004. 甲殼動物卵黃發生及其激素調控研究進展. 海洋科學,28(6): 66—70

Aoki H,Ahsan M N,Watabe S,2003. Molecular cloning and characterization of cathepsin B from the hepatopancreas of northern shrimpPandalus borealis. Comp Biochem Physiol B: Biochem Mol Biol,134(4): 681—694

Berti P J,Storer A C,1995. Alignment/phylogeny of the papain superfamily of cysteine proteases. J Mol Biol,246(2):273—283

Carnevali O,Carletta R,Cambi Aet al,1999. Yolk formation and degradation during oocyte maturation in seabreamSparus aurata: involvement of two lysosomal proteinases.Biol Reprod,60(1): 140—146

Carnevali O,Cionna C,Tosti Let al,2006. Role of cathepsins in ovarian follicle growth and maturation. Gen Comp Endocr,146(3): 195—203

Carnevali O,Sabbieti M G,Mosconi Get al,1995.Multihormonal control of vitellogenin mRNA expression in the liver of frog,Rana esculenta. Mol Cell Endocrinol,114(1—2),19—25

Cho W-L,Tsao S-S,Hays A Ret al,1999. Mosquito cathepsin B-like protease involved in embryonic degradation of vitellin is produced as a latent extraovarian precursor. J Bio Chem,274(19): 13311—13321

Fagotto F,1990a. Yolk degradation in tick eggs: I. Occurrence of a cathepsin L-like acid proteinase in yolk spheres. Arch Insect Biochem Physiol,14(4): 217—235

Fagotto F,1990b. Yolk degradation in tick eggs: II. Evidence that cathepsin L-like proteinase is stored as a latent,acid-activable proenzyme. Arch Insect Biochem Physiol,14(4): 237—252

Fagotto F,1995. Regulation of yolk degradation,or how to make sleepy lysosomes. J Cell Sci,108: 3645—3647

Finn R N,2007. Vertebrate yolk complexes and the functional implications of phosvitins and other subdomains in vitellogenins. Biol Reprod,76(6): 926—935

Hu K J,Leung P-C,2004. Shrimp cathepsin L encoded by an intronless gene has predominant expression in hepatopancreas,and occurs in the nucleus of oocyte. Comp Biochem Physiol B: Biochem Mol Biol,137(1): 21—33

Kageyama T,Takahashi S Y,1990. Purification and characterization of a cysteine proteinase from silkworm eggs.Eur J Biochem,193(1): 203—210

Kwon J Y,Prat F,Randall Cet al,2001. Molecular characterization of putative yolk processing enzymes and their expression during oogenesis and embryogenesis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Biol Reprod,65(6):1701—1709

LaFleur G J Jr,Raldúa D,Fabra Met al,2005. Derivation of major yolk proteins from parental vitellogenins and alternative processing during oocyte maturation inFundulus heteroclitus. Biol Reprod,73(4): 815—824

Laycock M V,Mackay R M,Di Fruscio Met al,1992. Molecular cloning of three cDNAs that encode cysteine proteinases in the digestive gland of the American lobster (Homarus americanus). FEBS Lett,292(1—2): 115—120

Le Boulay C,Van Wormhoudt A,Sellos D,1995. Molecular cloning and sequencing of two cDNAs encoding cathepsin L-related cysteine proteinases in the nervous system and in the stomach of the Norway lobster (Nephrops norvegicus). Comp Biochem Physiol B: Biochem Mol Biol,111(3): 353—359

Le Boulay C,Van Wormhoudt A,Sellos D,1996. Cloning and expression of cathepsin L-like proteinases in the hepatopancreas of the shrimpPenaeus vannameiduring the intermolt cycle. J Comp Physiol B,166(5): 310—318

Lecaille F,Kaleta J,Br?mme D,2002. Human and parasitic papain—like cysteine proteases: their role in physiology and pathology and recent developments in inhibitor design.Chem Rev,102(12): 4459—4488

Raldúa D,Fabra M,Bozzo M Get al,2006. Cathepsin B-mediated yolk protein degradation during killifish oocyte maturation is blocked by an H+-ATPase inhibitor: effects on the hydration mechanism. Am J Physiol,Regul Integr Comp Physiol,290(2): R456—R466

Selman K,Wallace R A,Cerdà J,2001. Bafilomycin A1 inhibits proteolytic cleavage and hydration but not yolk crystal disassembly or meiosis during maturation of sea bass oocytes. J Exp Zool,290(3): 265—278

Sire M-F,Babin P J,Vernier J-M,1994. Involvement of the lysosomal system in yolk protein deposit and degradation during vitellogenesis and embryonic development in trout. J Exp Zool,269(1): 69—83

Turk V,Stoka V,Vasiljeva Oet al,2012. Cysteine cathepsins:From structure,function and regulation to new frontiers.BBA-Proteins Proteom,1824(1): 68—88

Turk V,Turk B,Turk D,2001. Lysosomal cysteine proteases:facts and opportunities. Embo J,20(17): 4629—4633

Warner A H,Pullumbi E,Amons Ret al,2004. Characterization of a cathepsin L-associated protein inArtemiaand its relationship to the FAS-I family of cell adhesion proteins.Eur J Biochem,271(20): 4014—4025

Wu P,Qi D,Chen L Qet al,2009. Gene discovery from an ovary cDNA library of oriental river prawnMacrobrachium nipponenseby ESTs annotation. Comp Biochem Physiol D,4(2): 111—120

Zhao W H,Chen L Q,Qin J Get al,2011. MnHSP90 cDNA characterization and its expression during the ovary development in oriental river prawn,Macrobrachium nipponense.Mol Bio Rep,38(2): 1399—1406

Zhao W,Chen L,Zhang Fet al,2013. Molecular characterization of cathepsin L cDNA and its expression during oogenesis and embryogenesis in the oriental river prawnMacrobrachium nipponense(Palaemonidae). Genet Mol Res,12(4): 5215—5225