椒江口沉積物中細菌多樣性初步研究*

蔣 然 王健鑫① 黃 備 張 潘 鄭俊威 俞凱成 劉明華

(1. 浙江海洋學院 海洋微生物分子生態與應用實驗室 舟山 316022; 2. 浙江省舟山海洋生態環境監測站 舟山 316021)

微生物是生態系統中的生產者、消費者,也是分解者,在維持環境穩定的過程中起著動植物無法取代的作用(杜萍等,2012)。同時,由于微生物對環境變化十分敏感,其多樣性及群落結構常作為環境變化的指示因子(王金成等,2012; Zhuet al,2013)。

椒江是浙江省第三大河流,入臺州灣,其鹽淡水以強混合型為主,為典型的山溪性強潮河口,沉積物主要來自海域沙泥(謝欽春等,1998)。由于椒江口上游是化工、制藥、火力發電等企業的所在地,水體中已發現多溴聯苯醚(PBDEs)、滴滴涕(DDTs)、六六六(HCHs)、重金屬等多種污染物(江錦花等,2006; 余鵬等,2011; 楊華云等,2014),沉積物作為承載各種污染物的載體,其相關生物更是受到巨大的環境壓力。

關于椒江口生物與生態的研究起初關注較多的是大型底棲動物資源及魚類養殖環境調查,后來陸續開展了對蝦蟹、浮游動物等方面的研究(江錦花等,2007;趙永強等,2009; 杜萍等,2011a; 齊海明等,2013)。但對于包含巨大環境信息的微生物群落結構的研究,還比較欠缺: 杜萍等(2011b)首先對椒江口春季水體中異氧細菌及氮、磷細菌的生態分布特征進行了研究,其后又采用Biolog和PCR-DGGE技術對椒江口沉積物微生物多樣性進行了分析(杜萍等,2012),但主要側重于站點的多樣性指數及站點與石油烴的關系,并沒有對具體的細菌類群進行討論; Hu等(2012)分析了椒江口厭氧氨氧化細菌的多樣性與化學污染物(硝基苯,甲苯,多環芳烴等)的關系; Shen等(2014)采用分子生態學方法對椒江口氮依賴型厭氧甲烷氧化細菌進行了研究,上述兩個研究則是針對特殊的細菌種群,沒有涉及群落中其它類別細菌的多樣性及結構變化的相關信息。

本文采用常規生理生化及分子鑒定的方法對椒江口沉積物中可培養細菌的多樣性進行分析,并采用構建環境總 DNA克隆文庫方法,對未培養細菌的多樣性及系統發育進行研究,以期為椒江口沉積環境生態的相關研究提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2013年5月23日,在椒江口化工園區附近選擇C0 (28°41'27.6"N,121°26'49.2"E)、C1 (28°41'6"N,121°29'13.2"E)、C2 (28°40'32.16"N,121°33'32.4"E)3個站點(圖 1),每個站點采集表層沉積物樣品一份,在無菌條件下分裝于嚴格滅菌的樣品瓶內,-20°C保存,后置于實驗室-80°C超低溫冰箱中長期保存。

圖1 椒江口采樣站點Fig.1 Sampling station in the Jiaojiang River estuary

1.2 沉積物環境化學指標測量

常規水化學指標的測定參照海底沉積物化學分析方法(Heijset al,2008); 總有機碳含量(TOC)用總有機碳分析儀(TOC-V CSH,日本島津)進行測定; 總氮含量(TN)用蛋白質自動分析儀(SKALAR Primacs SN,荷蘭)進行測定; 總磷含量(TP)用鉬酸銨分光光度法進行測定(國標GB/T20260-200)。

1.3 可培養細菌的分離和鑒定

1.3.1 細菌分離純化 稱取10.0 g沉積物樣品,放入盛有90 mL已滅菌海水的錐形瓶(含玻璃珠)中,180 r/min震蕩 30 min。靜置使其自然沉降,取上清稀釋1000倍,涂布于Zobell 2216培養基,置于25°C培養,待長出明顯菌落后挑單菌落并反復劃線純化菌株。

1.3.2 細菌形態學鑒定 對分離純化得到的菌株,首先觀察并記錄菌落形態,進行革蘭氏染色,在確定是否生成芽孢之后,進行下列實驗(李振高等,2008):(1) 革蘭氏陽性芽孢桿菌: 測定菌株與氧的關系; (2)革蘭氏陽性無芽孢桿菌: 鏡檢菌體形態及其隨培養時間的變化; (3) 革蘭氏陰性無芽孢桿菌: 進行氧化酶實驗; (4) 菌體形態是球形者,要觀察其幼齡及老齡菌體形態,確定其沒有桿狀菌。

1.3.3 細菌生理生化鑒定 由于海洋細菌中革蘭氏陰性菌遠多于革蘭氏陽性菌,因此對所得菌株采用法國生物梅里埃公司的 API-20E(腸桿菌和其它革蘭陰性桿菌科鑒定系統)、API-20NE(非腸道革蘭陰性桿菌科鑒定系統)進行鑒定。API-20E和API-20NE能對需鑒定菌株進行23個生化試驗,并以其自身代謝產物的顏色變化或加入試劑后的顏色變化加以鑒定,結果進入數據庫檢索后得到相應的種名(黃備等,2009)。

1.3.4 細菌16S rDNA基因擴增及鑒定 選取典型可培養菌株,用細菌基因組 DNA提取試劑盒(TaKaRa公司)獲得菌株基因組 DNA,采用細菌 16S rDNA通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3')和1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行PCR擴增。50 μL反應體系為: 10×buffer 5 μL,dNTPs 0.5 μL,Primer 27F 1μL,Primer 1492R 1 μL,H2O 41 μL,Taq 酶(TaKaRa) 0.5 μL,模板 DNA 1 μL。PCR擴增條件為: 95°C預變性5 min; 94°C變性1 min,56°C退火30 s,72°C延伸2 min,循環35次; 最后72°C延伸10 min。PCR產物送上海美吉生物技術有限公司純化并進行DNA序列測定。選取長度超過1300 bp的序列進行 BLASTn(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比對,獲得相似性大于97%的同源類群序列信息。

1.4 未培養細菌多樣性研究

1.4.1 環境總DNA提取和16S rDNA擴增 利用FastPrep快速核酸提取儀(MP Biomedicals公司)和FastDNA spin kit for soil試劑盒進行沉積物DNA提取,核酸蛋白檢測儀(Bio-Rad公司)測定DNA濃度和純度,純化后用于PCR擴增。擴增采用引物341F(5'-CCTA CGGGAGGCAGCAG-3')和907R(5'-CCGTCAATTCC TTTGAGTTT-3')。擴增反應體系(條件)與可培養細菌分子鑒定相同。

1.4.2 未培養細菌克隆文庫構建及序列分析 PCR回收產物與pMD-18T vector (TaKaRa公司)在16°C連接過夜,將連接產物轉化到大腸桿菌(E. coli)DH5α感受態細胞(TaKaRa公司),經藍白斑篩選,挑選陽性克隆,重新擴增插入片斷,將含有合適大小插入片段的克隆送上海美吉生物技術有限公司進行測序。

獲得序列后,首先利用Bellerophon (http://compbio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl)在線去除嵌合體; 再應用BLASTn程序搜索相似性序列,進行系統發育分析。采用ClustalX (Version 1.8)對序列進行比對分析,通過 MEGA 5軟件構建系統發育樹(Kumaret al,2004),采用Neighbor-Joining建樹方法,建樹結果進行 Bootstrap1000次系統檢驗; 利用PHYLIP軟件包中DNASIS程序計算距離矩陣,利用DOTUR軟件將相似性＞97%的序列歸為一個 OTU,計算多樣性指數并繪制稀釋曲線(Schlosset al,2005)。未培養菌株16S rDNA的序列登錄號為: C0:KP016015—KP016127; C1: KP016128—KP016210;C2: KP016211—KP016297; 可培養菌株 16S rDNA的序列登錄號為: KP016596—KP016699。

2 結果與分析

2.1 樣品環境化學指標

椒江口C0、C1、C2站點沉積物樣品的環境化學相關指標如表1所示,從表1中可知,三個站點中C0的總有機碳(TOC)含量(6.74 g/kg)和總氮(TN)含量(528 mg/kg)最高,各站點間TOC和TN含量由高到低依次為為: C0＞C2＞C1; 而總磷(TP)含量最高站點為 C2(628mg/kg),TP含量在三個站點排序為: C2＞C1＞C0。

表1 椒江口沉積物環境化學指標Tab.1 Chemical measurements of sediment in Jiaojiang River estuary

2.2 純培養菌株的生理生化鑒定結果

分離純化得到 78株可培養細菌,其中革蘭氏陰性菌占 66.7%,革蘭氏陽性菌占 33.3%。細菌菌落絕大多數呈乳白色不透明、邊緣整齊光滑的形態,顯微鏡下細菌形狀以桿狀居多,大多數氧化酶反應呈陽性。根據菌落形態和菌體基本特征,我們挑選其中19株典型的革蘭氏陰性菌進行API-20NE及API-20E鑒定,結果如表2所示。細菌皆屬于變形菌門,其中52.6%為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(Aeromonas salmonicidasp.salmonicida),遠大于象山港等地海水樣品中所鑒定出的16.8%(黃備等,2009); 其余菌株所占比例較小,創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻膠弧菌(Vibrio alginolyticus)以及洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)各占 10.5%,產堿普羅威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、塔特姆氏菌(Tatumella ptyseos)、少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)各占5.3%。

2.3 純培養菌株16S rDNA分子鑒定

表2 典型可培養細菌常規鑒定結果Tab.2 Identifications of the culturable bacteria

選取43株菌株進行16S rDNA序列測定,得到41個片段長度為 1400bp左右的有效序列。通過BLASTn將所得序列進行比對,41個克隆子主要屬于4 個門類: 厚壁菌門(Firmicutes)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)以及 β-變形菌綱(Betaproteobacteria),各站點克隆文庫中不同類群細菌的比例如圖2所示。

三個站點中均有弧菌(Vibrio)、海洋芽孢桿菌(Oceanobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)的分布,其中弧菌在每個站點的比例都超過50%,為優勢菌種。相對于C0和C2而言,C1的多樣性更豐富,分布有其它站點沒有的類群,如: 產堿桿菌(Alcaligenes)、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)、節桿菌(Arthrobacter),但在C0和 C2站點也發現了 C1站點沒有的微小桿菌(Exiguobacterium),至于芽胞八疊球菌(Sporosarcina)則只在C2站點存在。

圖2 三個站點克隆文庫的類群比例Fig.2 The ratios of the clone libraries in taxonomic group of the three stations

利用 DOTUR將相似性＞97%的序列歸為一個OTU,41個克隆子共有14個OTU。并對所得OTUs進行16S rDNA系統發育樹的構建(如圖3所示)。由系統發育樹結果可知,厚壁菌門、芽孢桿菌綱、芽孢桿菌目的豐度和多樣性最為豐富(占 31.7%),其中芽孢桿菌屬有巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、黃海芽胞桿菌(Bacillus marisflavi)、短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)等種類; 另外還含有海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、芽胞八疊球菌屬(Sporosarcina)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)。γ-變形菌綱多樣性僅次于厚壁菌門,其基因序列都為弧菌屬,包括沙蠶弧菌(Vibrio nereis)、溶藻膠弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),其中C1B06的基因序列(含 23個菌株且在 3個站點均勻分布)與2007年江蘇暴發的大規模蛤蜊死亡有關的副溶血弧菌MM21有高同源性(Yueet al,2010)。β-變形菌門以及放線菌門僅有一個 OTU,分別屬于糞產堿菌(Alcaligenes faecalis)、原玻璃蠅節桿菌(Arthrobacter protophormiae)。

2.4 非培養細菌多樣性分析

2.4.1 非培養細菌16S rDNA文庫分析 每個站點選取 120個左右含有正確插入片段的細菌進行測序,返回的序列首先經過 sequin軟件去除載體,再通過Bellerophon網站去掉嵌合體,3個站點最終分別獲得113、84、89個有效克隆子,片段長度為550—700bp。

利用 DOTUR軟件,將相似性＞97%的克隆子歸為一個OTU,C0、C1和C2三個站點的OUT分別為59、57和72個。三個站點克隆文庫的多樣性指數如表3所示,C0、C1、C2三個站點Shannon指數依次遞增,Simpson指數依次遞減,說明C2站點的文庫多樣性最高,C1站點次之,C0站點最低,這與稀釋性曲線(圖4)所呈現的結果一致。從Chao1指數和Jack指數來看,C1站點擁有最高的物種豐富度(Richness)。導致豐富度指數與多樣性指數結果不一致的原因可能是多樣性指數除了受豐富度影響,還受到均勻度(Aveargeness)影響(Magurran,2011)。

表3 椒江口沉積物細菌多樣性指數一覽表Tab.3 Bacterial diversity indices in sediment of the Jiaojiang River estuary

2.4.2 三個站點克隆文庫物種類群分析 通過BLASTn搜索相似序列可將3個站點共286個克隆子可分為8個門(群),分別為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、CFB 群(Cytophaga-Flavobacterium-Bacterioides)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes); 另有 23.1%的細菌分類地位不確定; 這些相似序列主要來自于海洋或河流沉積物、海水或河水,少數來自土壤。

圖3 根據可培養細菌16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the culturable bacteria in 16S rDNA gene sequence

圖4 三個文庫的稀釋性曲線Fig.4 The rarefaction curve of three clone libraries

由圖5可看出: C0站點文庫擁有最多類群,主要由變形菌門及綠彎菌門構成,分別占 37.17%和26.55%,綠彎菌含量為3個站點中最高; 變形菌門以γ-變形菌綱為主要類群,占文庫的21.24%,明顯高于其余兩個站點γ-變形菌含量; 其次為α-變形菌綱,占10.62%,另有少量的 δ-變形菌綱和 β-變形菌綱。C1站點文庫所含類群最少,變形菌門為其最主要類群(占 60.71%)。變形菌門中 α-、β-、δ-所占比例為三個站點中最高,分別為23.81%、11.90%和11.90%。C2站點文庫同樣以變形菌門為主要類群,但其所占比例僅為32.59%,放線菌門也是C2站點文庫的優勢類群,占 17.98%,遠高于其余兩個站點的放線菌含量;同時值得注意的是,該站點分類地位未確定的細菌所占比例在3個站點中最高(33.71%)。

綜合3個站點文庫,變形菌門為最大優勢菌群占42.7%,其中 γ-變形菌占 16.8%,α-變形菌占 14.7%,δ-變形菌占6.3%,β-變形菌占4.9%,這與珠江及長江口沉積物中優勢菌群為 δ-變形菌有明顯差異(姜麗晶,2007; 王新新,2008); 僅次于變形菌門的是綠彎菌門(占 11.5%),這與西沙海槽表層沉積物中綠彎菌門所占比例(8.5%)相似(Liet al,2008); 第三大優勢菌群為放線菌門(占10.5%)。酸桿菌、變形菌、放線菌、CFB群在3個站點均有出現,但含量不高; 芽單胞菌只出現在C0站點; CFB group中的Latescibacteria只在C2站點中出現。

圖5 三個站點克隆文庫的類群比例Fig.5 The clone librariy ratios of the bacterial groups from the three stations

2.5 非培養細菌系統發育分析

2.5.1 C0站點非培養細菌系統發育分析 使用MEGA5.0軟件,將C0站點典型菌BLASTn的比對結果構建系統發育樹,結果如圖6。

由系統發育樹結果可知,α-變形菌綱中在 C0站點多樣性最為豐富,基因型C0_328(2個克隆子)與活性污泥中的未培養生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)克隆子DMSN111有高同源性(98%),與基因型C0_306(2個克隆子)有高同源性的相似序列則是分離自海水、與降解溴化甲烷有關的的可培養鞘氨醇單胞菌(Sphingomonadaceae Oxy6),基因型 C0_10(1個克隆子)的相似序列為美國墨西哥灣深水地平線事故區域的未培養α-變形菌克隆子S2-8-036,基因型C0_29(1個克隆子)與被脂肪族烴污染的土壤中的生絲微菌的克隆子(Hyphomicrobiumsp.CM38D10)有較高同源性(98%)。γ-變形菌綱在C0站點也有較多分布,基因型C0_69(含14個克隆子)與臺灣淡水河河口的未培養魚立克次體科的克隆子(Piscirickettsiaceae DS021)有較高同源性(97%),基因型 C0_323(2個克隆子)與被石油污染的西班牙 Cies群島潮下帶沉積物中未培養 γ-變形菌克隆子 RODAS-143有高同源性(99%),基因型 C0_44(1個克隆子)的序列與重金屬污染的比利時大陸板塊沉積物中未培養 γ-變形菌克隆子 beligica 2005/10-ZG-6相似度最高。δ-變形菌綱中基因型C0_6(2個克隆子)的相似序列為脂肪烴污染土壤中的未培養δ-變形菌克隆子CMOC10。

雖然綠彎菌門克隆子在C0站點總克隆子中所占比例高于變形菌門中的α-、γ-變形菌綱,但其多樣性遠不如以上兩種類群,這主要是由于綠彎菌門中克隆子大多歸屬于 C0_129基因型(24個克隆子),它與法國南部工業區被原油污染的Etang de Berre潟湖沉積物中的未培養綠彎菌克隆子17bis T0h-oil同源性為96%。C0_42(2個克隆子)的相似序列為法國 Guiana海岸與二氧化碳固定有關的未培養綠彎菌克隆子4_211。

硝化螺旋菌是一類可以將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽的細菌(李海艷,2009),在海洋氮循環里占據重要位置。C0站點的基因型 C0_128(9個克隆子)屬于硝化螺旋菌,與表層東海沉積物中的未培養硝化螺旋菌DH132B19有高同源性(98%),基因型C0_47(1個克隆子)的相似序列為德國Düsseldorf市Flingern地區被石油污染的沉積物中未培養硝化螺旋菌克隆子D15_16。

C0站點還含有一定數量的放線菌,共 8個克隆子分屬于4個OTU,其中基因型C0_88(5個克隆子)的相似序列為印度坎貝灣(臨近化工城市巴羅達)海濱土壤中的未培養放線菌 ONGS217,剩余 3個克隆子分屬于3個不同的OUT,其相似序列都來自污染環境,基因型 C0_1相似序列為德國 Düsseldorf市 Flingern地區被石油污染的沉積物中的紅色桿菌(Rubrobacteraceaesp. D15_40),基因型C0_332(1個克隆子)和基因型C0_334(1個克隆子)的相似序列為石油污染土壤中的兩個放線菌克隆子EK_CK647和EK_CK623。

在分類地位不確定的細菌中克隆子中,基因型C0_336(1個克隆子)與PAH污染的土壤中的未培養細菌克隆子PYR10d12有高同源性(99%)。

2.5.2 C1站點非培養細菌系統發育分析 使用MEGA5.0軟件,將C1站點典型菌BLASTn的比對結果構建系統發育樹,結果如圖7。

圖6 C0站點根據細菌16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of bacteria in 16S rDNA gene sequences in Station C0

圖7 C1站點根據細菌16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree of bacteria in 16S rDNA gene sequence in Station C1

由系統發育樹的結果可知,C1站點克隆文庫最主要類群依然為變形菌門中的 α-變形菌綱和 γ-變形菌綱。α-變形菌綱中,基因型C1_76(6個克隆子)相似序列為波羅的海及黑海中未培養 α-變形菌的克隆子D46,基因型C1_96(3個克隆子)相似序列為浙江水環境(濕地、紅樹林、海洋)沉積泥中能降解菲或芘以及能產 AHL的可培養鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.PQ-4)。γ-變形菌綱中,基因型C1_300(1個克隆子)和C1_311(1個克隆子)的相似序列都來自被石油烴污染的區域,前者為Etang de Berre潟湖海岸沉積物的γ-變形菌克隆子46 EDB3,后者為含水層的γ-變形菌克隆子 5_56_A9_b。C1文庫中 β-變形菌和 δ-變形菌所占比例明顯高于其它兩個站點。δ-變形菌綱中,基因型C1_113(4個克隆子)與來自高有機物輸入的低氧缺氧淡水沉積物中的未培養δ-變形菌克隆子MVS-83同源性為94%,基因型C1_3(3個克隆子)相似序列為北極Svalbard海灣的未培養δ-變形菌克隆子SS08_065。β-變形菌綱中基因型C1_133(6個克隆子)與湘江重金屬污染區域沉積物中所檢測到的未培養陶厄氏菌(Thauerasp. clone S-123)有高同源性(98%),基因型C1_334(1個克隆子)相似序列為原油污染的土壤中的產堿桿菌克隆子(Alcaligenessp. Clone Y251)。

C1站點還有一些其它基因型,C1_181基因型(4個克隆子)與石油污染的西班牙Cies群島的潮下帶沉積物的未培養擬桿菌克隆子 RII-OX020有高同源性(98%); 基因型 C1_342(1個克隆子)的相似序列為未培養酸桿菌門克隆子ANOX-038(來源環境與C1_181一樣); 基因型C1_316(1個克隆子)和C1_325(1個克隆子)的相似序列為石油污染土壤的未培養放線菌克隆子EK_CK623和EK_CK647。

在 C1站點分類地位未明確的細菌中,基因型C1_37(1個克隆子)的相似序列為法國Etang de Berre石油化工廠沉淀池中的未培養細菌克隆子 OX H12;基因型C1_319(1個克隆子)相似序列為美國北卡羅來納州工業煤氣廠的 PAH污染土壤中未培養細菌的克隆子P0X4b3C11。

2.5.3 C2站點非培養細菌系統發育分析 使用MEGA5.0軟件,將C2站點典型菌BLASTn的比對結果構建系統發育樹,結果如圖8。

由系統發育樹結果可知,C2站點主要優勢種群同樣為變形菌門的α-變形菌及γ-變形菌。γ-變形菌綱中,基因型C2_31(3個克隆子)與突尼斯Bizerte地區潟湖沉積物中的未培養 γ-變形菌克隆子 5m-84同源性為 95%,C2_337(2個克隆子)與重金屬污染的比利時大陸板塊沉積物中的未培養 γ-變形菌克隆子Belgica2005/10-130-24有高同源性(100%),C2_310(2個克隆子)與南大洋中與鐵肥效應有關的未培養魚立克次體科(Piscirickettsiaceae)克隆子C146300241有較高同源性(97%),基因型C2_29(1個克隆子)的相似序列為印度臨近化工城市巴羅達的坎貝灣的海濱土壤的未培γ-變形菌克隆子 ONGS147。α-變形菌綱中,基因型C2_2(1個克隆子)相似序列為南京鉛鋅礦殘渣污染的土壤中生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)克隆子H3-43,基因型 C2_313(1個克隆子)與污水處理廠氣溶膠中的Catellibacteriumsp. clone OTU-27-40m有高同源性(99%),基因型 C2_320(1個克隆子)與可降解原油的Altererythrobactersp. clone OB38-2有高同源性。β-變形菌綱中,基因型 C2_300的相似序列為湘江重金屬污染區域沉積物檢測到的未培養陶厄氏菌(Thauerasp. clone S-123)。δ-變形菌綱中,基因型C2_358(1個克隆子)與被原油污染的地中海 Mallorca島海岸沉積泥中未培養δ-變形菌克隆子MS-A223有較高同源性(98%)。

放線菌門為污染環境中十分活躍的類群(Nogaleset al,2001),在C2站點文庫中分布比較豐富。基因型C2_317(2個克隆子)相似序列為東海大陸架表層沉積物中的未培養放線菌克隆子 DH133B17; 基因型C2_27(2個克隆子)與浙江東陽填埋場沉積物中的放線菌克隆子 De371有較高同源性(97%); 基因型C2_333、C2_336和C2_352(均為1個克隆子)的相似序列來自同一個石油污染土壤環境,分別為未培養放線菌目克隆子 Actinomycetales bacterium clone EK_CK623、EK_CK647和 EK_CK647; 基因型C2_374(1個克隆子)和C2_72(1個克隆子)相似序列都來自印度臨近化工城市巴羅達的坎貝灣的海濱土壤,分別為未培養放線菌克隆子ONGS161、ONGS217。

酸桿菌門和擬桿菌門中各有一個基因型的相似序列來自石油污染的西班牙 Cies群島的潮下帶沉積物,分別為基因型 C2_371(1個克隆子)和基因型 C2_329(1個克隆子),它們的相似序列分別為未培養酸桿菌克隆子OXIC-127和未培養擬桿菌克隆子RII-OX047。

雖然其它細菌類群在C2站點的系統發育樹中所占比例較小,但典型基因型也有分布。硝化螺旋菌門中基因型 C2_13(2個克隆子)相似序列為東海大陸架表層沉積物的未培養硝化螺旋菌克隆子 DH132B19,綠彎菌門中基因型C2_314(2個克隆子)與富營養化湖泊沉積物中未培養綠彎菌克隆子 LakeCentre25有高同源性(99%),厚壁菌門中基因型C2_334(2個克隆子)與Bogota河中未培養厚壁菌克隆子RBE2CI-22有高同源性(99%)。

3 討論

3.1 可培養細菌多樣性

在對河口的微生物多樣性研究中,多數采用未培養方法(姜麗晶,2007; 王新新,2008),但如果想對微生物的應用及防治有深入研究,可培養微生物依然至關重要(周麗華等,2009)。為研究椒江口沉積物中可培養細菌,本文使用了常規分類純化、形態及生理生化指標和分子鑒定等方法,結果發現只有少數生理生化鑒定結果與分子鑒定結果一致,這一方面說明了生理生化鑒定由于其比對文庫的局限性——生理生化鑒定的數據庫主要針對醫院以及疾控系統,海洋環境的菌株數據較少(王國良等,2008),因此很多生理生化鑒定和分子鑒定結果不能完全統一; 但另一方面,大多數菌株生理生化鑒定結果如果放在高的分類階元(如門、綱、目等),其結果與分子鑒定結果將更加吻合,因此可以科學合理的利用生理生化與分子鑒定方法,加強可培養微生物的鑒定效率。

圖8 C2站點根據細菌16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree of bacteria in 16S rDNA gene sequences in Station C2

近年來圍繞海洋沉積物的可培養細菌多樣性開展了較多研究,李昭(2013)對南太平洋環流區深海可培養細菌的多樣性研究中發現,該區域的γ-變形菌綱在數量、種類、分布等方面都占主導地位(菌株數占81%); 盧婧雯等(2012)在對南海、東海近海可培養細菌的研究中發現,南海和東海分離菌株中γ-變形菌分別占35.5%和57.2%。上述研究從一定程度上證明γ-變形菌綱為沉積物中可培養細菌優勢菌群,同時也有多個研究報道了厚壁菌門也是沉積物可培養細菌中的優勢類群(Gontanget al,2007; 孫風芹等,2008;鄭瑩等,2012)。本實驗對可培養細菌的研究結果(γ-變形菌綱與厚壁菌門占 63.8%和 31.7%)與霍穎異等(2008年)對浙江蒼南近海沉積物可培養細菌多樣性的研究結果(γ-變形菌綱與厚壁菌門占68.4%和29.1%)類似,也印證了上述結論。

值得注意的是,三個站點都有副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)大量存在且分布均勻。副溶血性弧菌分為致病菌與非致病菌,其致病菌能引起食物中毒,主要分布在沿岸海水、海河交界處及海產食品中,有明顯的季節性特點,夏秋季該菌量遠大于其它季節(唐曉陽,2013)。本次采樣時間為副溶血性弧菌豐度低的春季,其異常高的豐度提示該地區水產養殖業需要加強對副溶血性弧菌疫情的監控。

3.2 未培養細菌多樣性

對于河口沉積物未培養細菌多樣性的相關研究已有較多報道,姜麗晶(2007)對珠江口沉積物微生物多樣性的研究表明: 變形菌門為最大優勢菌群,其中δ-變形菌綱(主要為硫酸鹽還原菌)為其主要組成部分,γ-變形菌綱則是第二優勢菌群。王新新(2008)對長江口沉積環境細菌多樣性的研究顯示: δ-和γ-變形菌綱分別占變形菌門的53.4%和47.2%。Feng等(2009)對長江口及沿岸區域沉積物細菌多樣性分析表明: γ-及δ-變形菌綱為該海域最主要的細菌類群。郭建麗等(2013)對雙臺子河口沉積物的研究結果顯示,δ-變形菌綱為絕對優勢類群,其次為γ-變形菌綱。上述研究都說明在河口環境中,變形菌門為最大優勢類群,多數又以 δ-變形菌綱所占比例最高,其次為 γ-變形菌綱。但也有很多關于海洋沉積物的研究中,顯示γ-變形菌綱才是未培養細菌的最主要類群(Bowmanet al,2003; Inagakiet al,2003; Websteret al,2006),王健鑫等(2012)對東海陸架表層沉積物的細菌多樣性研究也發現: 變形菌門為最大優勢菌群(占總克隆子數的41.5%),其中 γ-變形菌綱克隆子占比為 21.6%,這與本文對椒江口三個站點的研究結果(變形菌門和 γ-變形菌綱分別占比為42.7%和16.8%)相類似。椒江口相比長江和珠江河口,研究結果不盡相同,可能是由于椒江口區域的沉積物主要來自海域泥沙(謝欽春等,1998),而長江口及珠江口的沉積物主要來自河流流域(林承坤,1984; 江四義等,2008)。

Zhang等(2008)對維多利亞港及附近區域的沉積物的研究發現: 沉積物中的細菌類群與其所處環境是相互選擇的,相似沉積環境中的細菌類群也類似。但本文中三個站點間的細菌類群存在很大差異,最為明顯的是綠彎菌門,綠彎菌在 C0站點含量最高,占到26.55%,C2站點次之,占3.37%,C1站點則未擴增到綠彎菌16S rDNA序列,與此同時綜合總碳、總氮、總磷等理化指標來看,站點 C0＞C2＞C1,因此猜測綠彎菌與沉積環境的理化指標結果有一定的關聯性,也印證了綠彎菌門是水合物較少而有機質豐富的沉積物中的主要類群(李濤等,2008)。與綠彎菌相似,C1站點也沒有檢測到硝化螺旋菌的序列,硝化螺旋菌是一類好氧的硝化細菌,沉積物中的氧含量常能決定其分布(白潔等,2009),同時,它還對還原性硫化物敏感,一般存在于低硫環境(Kawaharaet al,2009),硝化螺旋菌的缺失可能暗示著C1站點沉積泥中溶解氧含量較低以及硫化物含量較高,這也與 C1站點沉積物中α-、δ-變形菌豐度高于另外兩個站點相一致,因為這兩類菌群在海洋沉積泥中主要是參與硫代謝(J?rgensen,1982; Nercessianet al,2005)。β-變形菌也是三個站點間有較明顯差異的類群,一般在污染環境中 β-變形菌占較高比例(Brümmeret al,2003)。C1站點為含β-變形菌最多的站點,其中大多數克隆子的相似序列為陶厄氏菌(Thauera),而陶厄氏菌屬的細菌具有相當廣泛的污染物降解能力,即使較難降解的芳香族化合物,它們也普遍具有良好的降解力(毛躍建,2009)。Candidate division WS3是C2站點特有的類群,目前關于此類群的研究并不詳細,但此類群主要出現在產甲烷環境(Dojkaet al,1998; Derakshaniet al,2001)。

3.3 環境與微生物的相關性

近些年相關研究顯示,椒江口已經成為世界上已報道沉積物中含 PBDEs最高的區域之一,且春秋兩季呈明顯的富營養化狀態(孫魯峰等,2012; 楊華云等,2014)。趙永強等(2009)針對椒江口大型底棲動物群落結構的研究表明,由于受重金屬和石油烴影響,耐污染能力較強的雙鰓內卷齒蠶(Aglaophamusdibranchis)、光滑狹口螺(Stenothyra glabra)、日本大眼蟹(Macrophthalmus japonicus)、短擬沼螺(Assiminea brevicula)成為此地優勢物種; 江錦花等在 2006和2007年對椒江口的鯔魚(Mugil cephalus)和縊蟶(Sinonovacula constricta)的研究也表明,這兩種典型生物富集了各種重金屬及石油烴,且其富集量受沉積物及水體中污染物的濃度影響。

通過對系統發育樹中相似序列來源環境的分析,可以更好地了解微生物群落與環境的關系(Clementinoet al,2007)。本實驗研究發現,椒江口沉積物中許多典型細菌的相似序列都來自污染環境,如: 石油污染的西班牙 Cies群島的潮下帶沉積物(基因型C0_323、基因型C1_181)、原油污染的Berre潟湖沉積物(基因型 C0_129)、脂肪烴污染的土壤(基因型C0_6)、重金屬污染的湘江沉積物(基因型 C1_133)、重金屬污染的比利時大陸板塊沉積物(基因型C2_337)、浙江東陽填埋場沉積物(基因型 C2_337)、高有機物輸入的低氧缺氧淡水沉積物(基因型C1_113)、富營養化湖泊(基因型 C2_314)等環境,同時,還有一些相似序列為降解石油烴的可培養細菌(基因型C0_306、基因型C1_96)。綜合其它研究者的結果,可以推測: 椒江口沉積物中的細菌多樣性及群落結構已經受到重金屬、石油烴以及水體富營養化等綜合污染的深度影響。

4 結論

本實驗通過常規分離純化、鑒定和構建細菌克隆文庫的方法,分別對椒江口三個站點沉積物中細菌的多樣性及群落結構進行了研究,研究發現: (1) 對可培養細菌而言,分子鑒定方法較生理生化鑒定方法更加準確,γ-變形菌為三個站點的優勢類群; (2) 對未培養方法得到的數據進行分析,C2站點多樣性最為豐富,γ-變形菌為三個站點的最大優勢類群; (3) 將系統發育樹上的基因型與相似序列比較,相當數量的相似序列來自重金屬或石油烴污染的沉積環境。

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