三疣梭子蟹幾丁質酶基因克隆鑒定及在低鹽脅迫和蛻皮周期中的表達分析*

張 鳳 呂建建 劉 萍① 高保全 李 健 陳 萍

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071; 2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306)

甲殼類幾丁質酶基因(Chitinase)屬于 18家族糖苷鍵水解酶多家族基因(Zhanget al,2014),幾丁質酶結構域典型: 第 18家族幾丁質酶催化結構域、富含S/T的連接區和結合幾丁質的結構域,其基本功能可以特異降解幾丁質。甲殼動物在蛻皮過程中必須通過Chitinase消化舊的幾丁質外骨骼。因此,Chitinase是甲殼動物生長不可或缺的酶。除此之外,Chitinase在甲殼動物中還具有其它重要的生理功能,包括消化幾丁質類食物以及參與免疫防御等(Arakaneet al,2010; Zhanget al,2014)。相比昆蟲而言(Zhuet al,2008; Arakaneet al,2010; Zhanget al,2011),由于缺少基因組背景,甲殼類Chitinase研究開展較晚,然而由于其重要性,近幾年已成研究熱點。目前在中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)、日本仿長額蝦(Pandalopsis japonica)以及日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)中均已開展Chitinase基因克隆、分類及功能研究。研究表明: 甲殼類幾丁質酶基因至少分六類(陳少波等,2004),可能在甲殼類蛻皮及消化中發揮重要作用(Huanget al,2010; Proespraiwonget al,2010; Zhanget al,2010;Rochaet al,2012; Zhanget al,2014)。

通過篩選本實驗室構建的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)高通量轉錄組文庫,發掘到一個三疣梭子蟹Chitinase基因,命名為PtCht。該基因在不同鹽度脅迫下三疣梭子蟹鰓組織中顯著差異表達(Lvet al,2013),且通過聚類分析發現其不屬于任何一個已知甲殼類Chitinase分類,反而與昆蟲Chitinase基因聚為一類,暗示其可能為甲殼類中新的Chitinase成員。本研究根據轉錄組文庫中PtCht基因部分序列,通過RACE技術克隆該基因cDNA全長; 通過實時定量 PCR研究該基因在三疣梭子蟹各組織中的表達分布以及在不同蛻皮時期中表達規律; 同時研究其在三疣梭子蟹低鹽脅迫進程中鰓和肝胰腺組織中的表達變化。研究結果將豐富甲殼類Chitinase研究內容,為進一步研究甲殼類Chitinase的功能提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料來自于本實驗養殖在昌邑市海豐水產養殖有限責任公司的健康三疣梭子蟹,體質量(5.78±1.11)g。暫養于 20m3的蟹池中,每池 200 只,共6池,暫養3d。自然海水養殖(鹽度33),水溫控制在24—26°C左右,pH 8.7,保持供氧充足,每天更換1/3的水量,暫養期間每天18:00喂食藍蛤。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

Trizol試劑分別提取各組織的總RNA,用核酸定量儀(Biodropsis,BO-1000)與1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA的質量及完整性; 分別取相同量的第六對鰓和肝胰腺的總 RNA 混勻,進行 3′和 5′RACE 的cDNA第一鏈的合成,具體方法參照 SMARTTMRACE Amplification Kit說明書。

1.3 全長cDNA的克隆及測序

根據從三疣梭子蟹 cDNA文庫中獲得的Chitinase的EST序列,利用Primer Premier 5.0軟件設計 3′RACE 和 5′RACE 特異性引物。3′和 5′末端擴增使用 Advantage 2 PCR Kit進行。用特異性引物Cht-F和通用引物UPM進行3′末端擴增,用特異性引物Cht-R和通用引物UPM進行5′末端擴增(表1),方法同段亞飛等(2013)。PCR 程序設為: 94°C 30 s,65°C 1 min,72°C 3 min,30 個循環。

1.4 序列分析

利用Vecror NTI 11.0軟件對測得的序列去除冗余序列并進行序列拼接,開放閱讀框的預測和氨基酸的翻譯用軟件DNAStar的EditSeq完成(徐文斐等,2014)。同源性比對、蛋白質理化性質預測、蛋白質功能結構域分析、蛋白信號肽分析、PtCht與其它物種的Cht氨基酸序列多序列比對、構建系統進化樹的具體方法見段亞飛等(2013)。

表1 三疣梭子蟹Chitinase克隆和mRNA相對表達分析所用引物序列Tab.1 Sequences of primers used for PtCht cloning and relative mRNA expression analysis

1.5 蛻皮周期實驗

將三疣梭子蟹放在20m3蟹池自然海水中暫養3d,分2個池子,每池150只,按照朱冬發(沈潔等,2011)的方法,用解剖剪剪下游泳足趾節末端置于干凈載玻片上,于Olympus CX21FS顯微鏡下觀察,分別挑出處于蛻皮間期、前期、后期的三疣梭子蟹各3只。分別取第1對鰓、第6對鰓、腸、胃、表皮、肌肉、肝胰腺、心臟、眼柄、血細胞,于液氮中凍存,用于RNA的提取。

1.6 鹽度脅迫實驗

隨機挑取暫養 3d的三疣梭子蟹分為 2組,對照組(自然海水33)和低鹽組(鹽度11),每組設3個平行,每個平行100只,于3m3蟹池中進行實驗。低鹽組鹽度配制方法為往自然海水中注入淡水,混勻,使其鹽度降至11,用YSI鹽度儀進行鹽度校準,具體方法見隋延鳴等(2012)。各組分別于脅迫0、3、6、12、24、48和72h取鰓和肝胰腺,每個時間點分別取3只三疣梭子蟹,于液氮中凍存,用于后續試驗RNA的提取。

1.7 PtCht基因mRNA Real-time PCR定量檢測

Trizol試劑分別提取對照組和實驗組三疣梭子蟹所取組織的總RNA,使用PrimeScript RT reagent Kit反轉錄合成cDNA。

根據已知的三疣梭子蟹管家基因 β-actin和拼接獲得的PtCht基因cDNA全長序列,分別設計一對正反特異引物(β-actin-F和β-actin-R、QCht-F 和 QCht-R)(表 1-1),對不同時間中鹽度脅迫的三疣梭子蟹鰓和肝胰腺中PtCht基因的相對表達量進行檢測。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀上利用Real-time PCR方法對脅迫進程中以及各個組織中PtCht基因的表達情況進行分析。采用 2–ΔΔCt方法計算PtCht基因的相對表達量,使用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取

利用 Trizol試劑提取獲得三疣梭子蟹所取各個組織的總 RNA,經核酸定量儀檢測,其 OD260/OD280均在1.9—2.0之間,總RNA有較高的純度; 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,呈現 3條清晰的條帶,分別是28S RNA、18S RNA和5S rRNA,表明總RNA完整性較好,可用于進行后續實驗。

2.2 PtCht基因的全長cDNA克隆

以三疣梭子蟹鰓、肝胰腺和肌肉組織的總 RNA混合物為模板,反轉錄得到 3′RACE 和 5′RACE 的cDNA第一鏈。以特異引物Cht-F和Cht-R分別與通用引物UPM配對,進行3′和5′RACE擴增,分別獲得大小為857bp和630bp的cDNA片段。將兩片段與已知表達序列標簽(EST)拼接,得到三疣梭子蟹幾丁質酶 Chitinase基因 cDNA全長序列,命名為PtCht,GenBank登錄號: KM100753。該基因cDNA序列全長為3694bp,其中,開放閱讀框(ORF)3039bp,5′端非編碼區(5′-UTR)200bp,3′非編碼區(3′-UTR)455bp。3'端存在加尾信號AATTAAA和多聚腺苷酸Poly A尾(圖 1)。

2.3 PtCht基因序列分析及結構域預測

氨基酸序列分析可知,PtCht基因編碼一個由1012個氨基酸組成的的蛋白質,分子量為 113.4kDa,理論等電點為6.289。氨基酸組成分析表明,PtCht蛋白帶有負電的氨基酸殘基為127個(Asp和Glu),帶有正電的氨基酸殘基為116個(Arg和Lys),疏水性氨基酸殘基為316個(Ala,Ile,Leu,Phe,Trp和Val),極性氨基酸殘基為253個(Asn,Cys,Gln,Ser,Thr和Tyr),不穩定系數為 36.25,親水性總平均數為–0.458,屬于穩定蛋白。結構域分析表明,其N端含有21個氨基酸組成的信號肽,InterProScan軟件分析表明,PtCht序列存在兩個幾丁質酶第 18家族活性位點228FDGLDLDWE236,664FDGLDIDWE672。在 113—457氨基酸和549—894氨基酸處分別存在兩個幾丁質酶第 18家族催化結構域,在 946—1004氨基酸處存在含6-Cys的Type-2幾丁質結合結構域(ChtBD2)。

2.4 PtCht基因的同源性分析

BLAST同源性分析三疣梭子蟹PtCht的氨基酸序列,得知三疣梭子蟹PtCht基因與亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)Cht的同源性最高,為74%。與其它物種如翅膀帶黑白斑的果蠅(Drosophila grimshawi)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiastr.)、嗜鳳梨果蠅(Drosophila ananassae)、黑翅果蠅(Drosophila persimilis)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的同源性分別為67%、73%、72%、72%和72%。通過與亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)和家蠶(Bombyx mori)等動物的 Cht氨基酸序列比對發現,幾丁質酶第 18家族的催化結構域保守基序MotifⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和含6個Cys的幾丁質結合結構域ChtBD2在幾個物種中都存在(圖2)。

利用MEGA 5.0軟件進行系統進化分析表明,第18家族Ⅲ型幾丁質酶主要聚為兩大類群: 昆蟲類和甲殼動物,三疣梭子蟹(P. trituberculatus)與昆蟲類黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiastr.)緊密聚為一支,之后的聚類順序依次為與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)等(圖 3)。

2.5 PtCht基因組織表達分析

2.5.1PtCht基因的組織表達分布 利用實時熒光定量 PCR分析了三疣梭子蟹PtCht基因在不同組織中的表達分布特征,結果表明,PtCht基因在第 1對鰓、第6對鰓、眼柄、肝胰腺、血細胞、心臟、肌肉、胃和腸中均有表達。在所有實驗組織中,表達量最高的是表皮,依次是眼柄、胃、第6對鰓、第1對鰓、腸、肌肉、和心臟,而在肝胰腺和血細胞中的表達量非常低(圖4)。

2.5.2PtCht基因在不同蛻皮周期中的表達分析三疣梭子蟹不同蛻皮周期中PtCht基因在表皮和眼柄中的相對表達量如圖5所示。與間期相比,在表皮中,前期PtCht基因的相對表達量出現顯著下調,后期PtCht基因的相對表達量出現顯著上調; 與間期相比,在眼柄中,前期和后期PtCht基因的相對表達量呈整體上調趨勢。

2.5.3PtCht基因在鹽度脅迫中的表達分析 三疣梭子蟹鹽度脅迫后PtCht基因在第六對鰓中的相對表達量如圖 6所示。與對照組相比,低鹽脅迫組中,PtCht基因的相對表達量于低鹽脅迫 3h后出現顯著下調,6h出現輕微的上調后,于12h達到最小值,相對表達量為對照組的0.30倍(P＜0.05); 隨后,PtCht的相對表達量開始顯著上調,于24h達到最大值,相對表達量分別為對照組的2.27倍(P＜0.05),隨后相對表達量于48—72h再次出現下調現象(圖6)。

圖1 三疣梭子蟹PtCht基因cDNA全長核苷酸序列和其推導出的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PtCht gene起始密碼子(ATG)、加尾信號(AATTAAA)和終止密碼子(TGA)用細線方框標出; 粗線方框內為幾丁質酶第18家族保守基序; 信號肽以細下劃線標出; ChtBD2結構域用粗下劃線標出

圖3 三疣梭子蟹幾丁質酶蛋白PtCht的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis on chitinase protein of P. trituberculatus三疣梭子蟹幾丁質酶蛋白PtCht; 各物種幾丁質酶蛋白Cht GenBank登錄號: 日本沼蝦Cht1A (KF466274.1); 日本沼蝦Cht1B(KF466275.1); 日本沼蝦Cht1C (AHL24866.1); 日本沼蝦Cht3A (KF466276.1); 日本沼蝦Cht3B (KF466277.1); 日本沼蝦Cht3C(KF466278.1); 日本沼蝦Cht4 (KF466279.1); 中國對蝦Cht1 (ABB85237.1); 中國對蝦Cht3 (DQ000159.1); 斑節對蝦Cht1 (AAD40313.1);斑節對蝦Cht2 (ADG22164.1); 斑節對蝦Cht3 (ADG22163.1); 鋸緣青蟹Cht (ABY85409.1); 鋸緣青蟹Cht1 (ACG60512.1); 鋸緣青蟹Cht2 (ACZ53950.1); 日本蟳Cht (AFF59213.1); 日本囊對蝦Cht1 (BAA12287); 日本囊對蝦Cht2 (BAA14014); 日本囊對蝦Cht3(BAA22854); 凡納濱對蝦Cht1 (EU883591.1); 凡納濱對蝦Cht2 (EU861222.1); 凡納濱對蝦Cht3 (AAN74647.1); 凡納濱對蝦Cht4(FJ888480.1); 凡納濱對蝦Cht5 (FJ888481.1); 凡納濱對蝦Cht6 (GQ916594.1); 日本仿長額蝦Cht (AFC60660.1); 日本仿長額蝦Cht1(JF694836.1); 日本仿長額蝦Cht2 (JN982965.1); 日本仿長額蝦Cht3 (JF694838.1); 日本仿長額蝦Cht4 (JF694837.1); 黑腹果蠅Cht5(NP_650314.1); 黑腹果蠅Cht7 (NP_647768.2); 黑腹果蠅Cht8 (NP_611542.1); 黑腹果蠅Cht10 (EAA46011.1); 赤擬谷盜 Cht5(NP_001034524.1); 赤擬谷盜Cht7 (NP_001036035.1); 赤擬谷盜Cht8 (NP_001036067.1); 赤擬谷盜Cht10 (NP_001038091.1); 岡比亞按蚊Cht5-1 (HQ456129); 岡比亞按蚊Cht7 (XP_308858.4); 岡比亞按蚊Cht8 (XP_316448.2); 岡比亞按蚊Cht10 (XP_317398.3); 麗蠅蛹集金小蜂Cht5(NP_001155084.1); 亞洲玉米螟Cht (AGX32025.1); 小菜蛾Cht (AFI55112.1); 甜菜夜蛾Cht7 (AFM38213.1)

Real-time PCR檢測了三疣梭子蟹鹽度脅迫后不同時間點肝胰腺中PtCht基因的相對表達情況。與對照組相比,低鹽脅迫后,PtCht基因的相對表達量于3 h出現下調現象,并于 12 h達到最小值,差異顯著(P＜0.05); 隨后于12—48 h出現顯著上調,并于48 h達到最大值,相對表達量為對照組的4.63倍(P＜0.05),然后于48—72 h出現下調現象(圖7)。

圖4 三疣梭子蟹PtCht基因在不同組織中的表達分布Fig.4 Distribution of PtCht gene expression in different tissues of P. trituberculatus不同組織表達量均以與血細胞相比較的倍數表示,不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)

圖5 不同蛻皮周期三疣梭子蟹表皮和眼柄中PtCht基因的表達情況Fig.5 Expression of PtCht gene in P. trituberculatus cuticle and eyestalk tissues during different molting cycle不同組織各蛻皮周期表達量均以與表皮前期相比較的倍數表示,同組織不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)

3 討論

幾丁質酶在甲殼動物的蛻皮過程中起著重要的生理作用,消化舊的外骨骼,將其變成可溶性物質,部分被機體重吸收,合成新的外骨骼(Huanget al,2010)。本實驗克隆出一個全長為3694bp的幾丁質酶基因PtCht。結構預測發現PtCht存在典型的幾丁質酶結構,表明其具有幾丁質分解活性,確為第 18家族幾丁質酶家族成員(陳少波等,2004)。進化樹分析表明其于已知的任何一種甲殼類幾丁質酶成員均聚不到一類,反而與昆蟲幾丁質酶基因聚為一支,PtCht含有兩個催化結構域,昆蟲Ⅲ型幾丁質酶也有兩個催化結構域(Zhuet al,2008),廣泛存在于昆蟲、節肢動物中的Ⅲ型幾丁質酶都歸于第18 家族(Bormannet al,1999),暗示PtCht可能與昆蟲一些幾丁質酶基因同源。

圖6 低鹽脅迫下三疣梭子蟹第六對鰓中PtCht基因的表達情況Fig.6 Expression of PtCht gene in P. trituberculatus gill tissue under low salinity stress低鹽脅迫后不同時間點表達量均以與各時間點對照相比較的倍數表示,不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)

圖7 低鹽脅迫下PtCht基因在三疣梭子蟹肝胰腺中的表達變化Fig.7 Expression of PtCht in P. trituberculatus hepatopancreas tissue under low salinity stress低鹽脅迫后不同時間點表達量均以與各時間點對照相比較的倍數表示,不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)

甲殼動物個體的生長發育伴隨有周期性的蛻皮過程。眼柄-竇腺復合體為甲殼類重要的神經內分泌器官,是甲殼類蛻皮調控的重要器官,而甲殼類蛻皮首先需要降解舊的幾丁質表皮,之后合成新的幾丁質表皮,顯而易見,眼柄和表皮是調控甲殼類蛻皮的關鍵組織。研究發現,甲殼動物幾丁質酶在甲殼動物蛻皮周期中發揮作用,但基因不同,其在蛻皮過程中起的作用也可能不同(呂黎等,2011)。日本對蝦(Penaeus japonicus)PjCht2(Watanabeet al,1996;Watanabeet al,1997)、斑節對蝦(Penaeus monodon)PmCht1(Tanet al,2000)和PmCht2(Zou,2009)、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis) (Priyaet al,2009)FcCht1和FcCht3、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)(Zhanget al,2014)MnCht1A、MnCht1B和MnCht3B等幾丁質酶基因的表達在甲殼動物不同蛻皮階段中表現出一定的波動變化,這種變化和血淋巴中的蛻皮激素含量存在相關性(呂黎等,2011)。

本實驗組織表達分布結果表明,PtCht基因在所研究組織中均有表達,在表皮和眼柄中表達量較高,說明該基因的主要功能很可能與三疣梭子蟹蛻皮相關。與間期相比,在表皮中,前期PtCht基因的相對表達量出現顯著下調,后期PtCht基因的相對表達量出現顯著上調,表達量達到最大; 與間期相比,在眼柄中,發現PtCht在蛻皮前期表達上調,到后期表達量達到最大,表明幾丁質酶 mRNA的表達可能受到了蛻皮激素的調節而參與蛻皮過程。這與昆蟲第十八家族幾丁質酶 groupⅠ基因的時空表達特性基本一致,東亞飛蝗(Locusta migratoria)LmCht1也是在表皮中特異表達,并在昆蟲發育后期表達量越來越高; 東亞飛蝗LmCht6在表皮中表達量也較高,隨著昆蟲發育表達量越來越高,到成蟲階段,表達量降低; RNAi結果表明LmCht6在東亞飛蝗蛻皮過程中發揮著非常重要的作用(李大琪等,2011)。作為昆蟲Ⅲ型幾丁質酶成員赤擬谷盜TcCht7和黑腹果蠅DmCht7可能在組織分化中起作用(Renet al,2005),純化的壁虱Ⅲ型幾丁質酶存在于新舊表皮之間,在蛻皮生理中發揮著一定的作用(Youet al,2003)。

鹽度變化可以開啟甲殼動物個體本身的滲透壓調節機制,在一定閾值內,鹽度的下降會導致甲殼動物蛻皮發育周期的縮短、蛻皮率增高,從而促進甲殼動物的生長(Brayet al,1994; Muet al,2005; 楊其彬等,2008; 王沖等,2010)。鰓又是三疣梭子蟹的重要器官,可以在水中進行氣體交換,調節滲透壓和調節離子平衡(韓曉琳等,2014)。比較本實驗室轉錄組研究結果發現,該基因在不同鹽度脅迫下三疣梭子蟹鰓中表達具有顯著差異(Lvet al,2013),這些結果均暗示第六對鰓可能參與三疣梭子蟹滲透壓調節進程。低鹽脅迫下PtCht基因的表達在第六對鰓中總體呈先下調后稍微回升再下調到最低,再回升最后又下調的表達規律,在肝胰腺中呈現先下調后回升再下調的表達規律。表明PtCht基因參與了三疣梭子蟹低鹽脅迫應答,在其透壓調節進程中起到了一定的作用,提高了三疣梭子蟹抵抗鹽度脅迫的能力,但是其具體的調節機制還有待于進一步的探索。

4 結論

首次克隆出了三疣梭子蟹PtCht基因cDNA序列全長,分析PtCht基因在三疣梭子蟹蛻皮周期和低鹽脅迫進程中的表達規律,得知PtCht基因在三疣梭子蟹蛻皮發育和滲透壓調節中都發揮了一定的作用,可初步認為PtCht參與了三疣梭子蟹的鹽度適應性調節過程,進一步推測PtCht可能是鹽度影響三疣梭子蟹蛻皮的重要調控因子之一,為深入研究幾丁質酶在三疣梭子蟹和其它甲殼動物蛻皮機制中的功能提供了重要信息。

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