以花藥為受體的小麥轉基因技術體系的構建

高潔等

摘要：為了在轉化當代獲得純合的轉基因株系，本試驗對以小麥花藥為受體的轉基因方法進行了系統研究。結果表明，金粉粒度0.6μm、金粉濃度100μg/槍、轟擊距離6cm、轟擊壓力1300psi為基因槍轉化小麥花藥的最佳參數組合。用含有5%DMSO的0.2%秋水仙堿溶液處理單倍體植株4h，染色體加倍效率最高，達到100%；用含1%DMSO的溶液處理12h加倍效率最低，為62.2%。PCR結果顯示所有T0代陽性植株在T1代都無分離，說明該方法得到的轉基因株系在T0代即為純合系。本研究成功建立了以花藥為受體的小麥轉基因技術體系，為小麥遺傳改良提供了一種新的方法。

關鍵詞：小麥；轉基因；受體；花藥；染色體加倍

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）01-0001-06

小麥是重要的糧食作物之一，小麥生產的可持續性對于保障糧食安全至關重要。然而，由于缺少高抗生物或非生物逆境的小麥種質資源，在有限的土地資源上進一步提高小麥產量異常艱難。轉基因技術為利用異源基因改良小麥的抗逆性、實現種質資源創新的新突破提供了新的機遇[1]。

愈傷組織誘導和再生是小麥轉基因的關鍵步驟，迄今為止，已成功用于小麥遺傳轉化的外植體有幼胚[2，3]、幼穗[4]、花藥誘導后的胚狀體[5，6]、小孢子[7]、成熟胚[8]等。這些外植體中，除了花藥誘導后的胚狀體和小孢子為單倍體外，其余皆是二倍體。由于小麥基因組龐大，含有42條染色體，轉基因后代純合過程較慢。而以單倍體為受體的轉基因植株經過染色體加倍，可以在轉化當代獲得純合株系，大大縮短出圃年限。影響染色體加倍效率的因素有很多，植株的發育狀態、試劑的種類、處理時間等都會對加倍效率產生影響[9]。秋水仙堿是目前應用最為廣泛的加倍劑，但處理不當會對植株產生致死性的傷害[10]。

到目前為止，未見有以小麥花藥作為轉基因受體的報道。以花藥為受體的小麥轉基因技術首先要獲得轉化的單倍體植株，然后經過染色體加倍得到可育的轉基因后代。為了建立以小麥離體花藥為受體的外源基因導入技術體系，探索高效的染色體加倍技術，本試驗對影響小麥基因槍轉化和單倍體加倍的因素進行了詳細的研究，建立了以花藥為受體的小麥轉基因技術體系。

1材料與方法

1.1質粒及試劑

本試驗所用的質粒為pHAC25，由山東省農業科學院作物所分子生物學實驗室保存。

質粒提取試劑盒購自天根生物；培養基配制所需的無機鹽購自國藥集團；維生素和抗生素以及激素、GUS染色所需的藥品購自Sigma公司；金粉及基因槍轉化過程中所需的耗材均購自伯樂公司。

1.2花藥的分離與預處理

花藥供體品種為K35，是山東省農科院作物所自行選育的具有良好花藥培養能力的高代小麥品系。顯微鏡下觀察花藥發育情況，選擇單核靠邊期的花藥（圖1A），放入盛有0.3mol/L甘露醇預處理液的培養皿中，每皿500粒，4℃放置約16h（圖1B）。將浸泡完全的花藥轉移到誘導培養基上（培養皿下放有畫有基因槍轟擊圈的白紙），每皿500粒，用于基因槍轉化。

1.3子彈制備與花藥轉化

取金粉10mg，70%乙醇沖洗，10000r/min離心1min，重復3次，加入1ml滅菌水振蕩2min，制成終濃度為10μg/μl的金粉貯藏液。將金粉貯藏液充分渦旋，取100μl放入硅化的1.5ml離心管中，14000r/min離心30s，棄上清；加入50μl滅菌水懸浮金粉，在振蕩器上邊輕微振蕩邊加入1μg/μl的質粒10μl，再加入20μl新配制的0.1mol/L的亞精胺和50μl2.5mol/L的CaCl2，高速蝸旋3min，將離心管在冰上放置約2min讓金粉自然沉淀，10000r/min離心10s，棄上清；加入無水乙醇750μl，高速蝸旋，冰上放置約2min讓金粉自然沉淀，10000r/min離心10s，棄上清，用100μl無水乙醇懸浮。

將制備的子彈用基因槍轟擊預處理后的花藥。

1.4誘導培養與再生苗的篩選及染色體加倍

于無菌操作臺中將轟擊后的花藥轉移到花藥愈傷誘導培養基上（圖1C），32℃暗培養3d后，28℃暗培養約4周，獲得胚狀體（圖1D）。將1～2mm左右的胚狀體轉移到含有5mg/Lbiolaphos的再生培養基上，25℃下進行再生篩選培養（每天光照16h，光照強度5000lx）。

將高5cm左右的再生苗移栽到裝有栽培基質的花盆中，用打孔的廢棄礦泉水瓶罩住小苗，晝夜溫度保持14℃，每天光照14h。有2～3個分蘗時，將幼苗從花盆中取出，流水洗凈根部，修剪幼苗，使根長或葉長保留3cm左右。將修剪好的幼苗根部完全浸入含有不同濃度DMSO的0.2%的秋水仙堿加倍液中，18℃恒溫培養。通氣裝置采用普通魚缸通氧機。將處理完畢的幼苗，流水沖洗根部3h，移栽到裝有栽培基質的花盆中，用打孔的廢棄礦泉水瓶罩住小苗，晝夜溫度保持14℃，每天光照14h，待新蘗產生時，轉移到17～25℃的環境中，直至成熟收獲，即為T0代植株。

1.5轉基因植株GUS染色

GUS組織染色液的配制：0.2mol/L磷酸鈉緩沖液1ml；0.1mol/L亞鐵氰化鉀和0.1mol/L鐵氰化鉀各1ml；0.5mol/LNa2-EDTA8ml；200mgX-gluc溶于400μlDMSO中；加水定容至200ml。

GUS組織染色：取待檢測組織，剪斷或切開后分別放入5ml離心管中，用GUS染色液完全浸沒，37℃振蕩過夜，次日用70%乙醇沖洗2～3次，觀察染色結果。

1.6轉基因植株純合體驗證

為驗證轉基因植株是否為純合，對T0代植株和來自同一個T0代單株的10個T1代植株進行PCR檢測，檢測對象為GUS基因。正向引物為5′-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3′，反向引物為5′-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3′，PCR產物長度為616bp。PCR擴增程序：95℃預變性5min；95℃變性1min，52℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸5min。

2結果與分析

2.1不同金粉濃度和轟擊壓力對轉化效率的影響

本試驗首先設計3個轟擊壓力和3個金粉濃度，進行9個試驗處理，每個處理轉化花藥2000個，具體結果見表1。

從表1可以看出，在花藥數目相同的情況下，900psi的轟擊壓力下，3個金粉濃度都沒有得到陽性植株；1100psi的轟擊壓力下，每槍金粉用量為60μg時得到3個陽性植株，每槍金粉用量為100μg時，得到5個陽性植株，其轉化效率分別為0.15%和0.25%；而在1300psi的轟擊壓力下，3個濃度的金粉都得到陽性植株，其中每槍用量為100μg時轉化效率最高，達到0.60%。

2.2不同金粉粒度對轉化效率的影響

依據上述試驗數據，確定了1300psi轟擊壓力和每槍100μg的金粉用量為適宜參數，在培養條件和轟擊壓力、金粉濃度等轟擊參數不變的情況下，對0.6μm和1.0μm兩種不同粒度的金粉進行了轉化效率試驗，每個處理轉化花藥2000個。結果顯示，0.6μm的金粉轟擊花藥獲得胚狀體652個，陽性植株9個，轉化效率為0.45%；而1.0μm金粉轟擊花藥獲得胚狀體703個，陽性植株5個，轉化效率為0.25%。

2.3不同轟擊距離對轉化效率的影響

在上述參數不變的情況下，設定6cm和9cm兩個轟擊距離，每個處理轟擊花藥2000個。其中轟擊距離為6cm時，獲得胚狀體663個，陽性植株10個，轉化效率為0.50%；而轟擊距離9cm時，獲得胚狀體861個，沒有陽性植株。

根據上述3個試驗獲得的數據，確定金粉粒度0.6μm、每槍金粉用量100μg、轟擊距離6cm、轟擊壓力1300psi為花藥轉化的最佳參數組合。

2.4通氣方式和不同修剪方式對加倍效率的影響

如表2所示，當單倍體植株根和葉都被修剪至3cm左右時，通氣情況下，植株存活率和加倍效率都達到100%；不通氣時，只有76株存活，存活率為84.4%，存活的植株全部加倍。只修剪根部時，兩種情況下的加倍效率與根葉皆剪時沒有明顯差別，分別為99.9%和83.3%。但是，只作修剪葉片而不剪根時，植株的加倍效率明顯降低，兩種情況下的加倍效率分別為62.2%和57.8%。如果根葉都不剪，通氣時的加倍效率為45.6%，不通氣時為44.5%。因此，單倍體的加倍效率受通氣和修剪方式的雙重影響，通氣可以極大提高植株的存活率，修剪可以提高存活植株的加倍率。

2.5不同DMSO濃度和處理時間對加倍效率的影響

將具有2～3個分蘗的單倍體植株的根和葉分別修剪至3cm左右，在含有不同濃度DMSO的0.2%的秋水仙堿溶液中分別加倍處理4、8、12h。如表3所示，DMSO濃度和處理時間對植株的存活率有明顯影響，但對收獲指數影響不明顯。在含有5%DMSO的秋水仙堿溶液中處理4h或8h，單倍體加倍效率均最高，為100%，其中以4h為最佳處理時間；用含1%DMSO的溶液處理12h，加倍效率最低，為62.2%。

3結論與討論

3.1金粉粒度、濃度和轟擊壓力、距離對轉化效率的影響

自基因槍轉化方法發明以來，針對不同作物和組織的轉化參數已經建立[11，12]。就小麥而言，對誘導后愈傷組織的轉化體系已經有了非常系統的研究，金粉粒度1μm、每槍30μg、轟擊距離9cm是幼胚轉化常用的參數[13，14]。本試驗首次對基因槍轉化花藥的參數進行了研究，結果表明金粉粒度0.6μm、每槍100μg、轟擊距離6cm是基因槍轉化花藥的最佳參數。不同組織之間轉化參數的差異，可能與外植體的細胞結構有關?；ㄋ幨且粋€高度發達的器官，外面一層是花藥壁，里面包被著無數微小的小孢子，轉化花藥所產生的單倍體轉基因植株實際上是由小孢子分化產生的。微小的小孢子可能跟粒度微小的金粉顆粒更相配，因此，0.6μm的金粉轉化效率更高。而相對堅硬的花藥壁需要比愈傷組織更大的沖擊力，因此，6cm的轟擊距離、1300psi的轟擊壓力轉化效率更高。

3.2植株修剪方式、通氣、DMSO濃度和處理時間對染色體加倍效率的影響

單倍體誘導和染色體加倍是花藥培養的兩個關鍵步驟。在這一過程中，基因型、培養基、培養環境對誘導效率和再生能力都有非常大的影響，隨后的單倍體加倍過程又受單倍體生長狀態、加倍藥劑的種類和處理方式等多種因素的影響[9]。小麥的花藥培養自20世紀60年代成功以來，已有大量關于提高愈傷誘導效率和單倍體加倍效率的研究，秋水仙堿是應用最為廣泛的加倍劑，通常用法為用0.1%～0.2%的秋水仙堿處理幾個小時，但是加倍效率在不同的報道中差異很大，而且往往伴隨著較高的死苗率[15，16]。DMSO具有穩定細胞骨架、免受外來因素損傷的作用。本試驗中5%DMSO處理提高了植株存活率，進一步證實了DMSO對細胞的保護作用。隨著處理時間的延長，不同濃度DSMO處理的植株存活率均明顯降低，表明秋水仙堿的積累會嚴重影響植株存活率。本試驗結果顯示在含有5%DMSO的0.2%秋水仙堿溶液中，處理根葉均經過修剪的單倍體植株4h，加倍效果最好。

2結果與分析

2.1不同金粉濃度和轟擊壓力對轉化效率的影響

本試驗首先設計3個轟擊壓力和3個金粉濃度，進行9個試驗處理，每個處理轉化花藥2000個，具體結果見表1。

從表1可以看出，在花藥數目相同的情況下，900psi的轟擊壓力下，3個金粉濃度都沒有得到陽性植株；1100psi的轟擊壓力下，每槍金粉用量為60μg時得到3個陽性植株，每槍金粉用量為100μg時，得到5個陽性植株，其轉化效率分別為0.15%和0.25%；而在1300psi的轟擊壓力下，3個濃度的金粉都得到陽性植株，其中每槍用量為100μg時轉化效率最高，達到0.60%。

2.2不同金粉粒度對轉化效率的影響

依據上述試驗數據，確定了1300psi轟擊壓力和每槍100μg的金粉用量為適宜參數，在培養條件和轟擊壓力、金粉濃度等轟擊參數不變的情況下，對0.6μm和1.0μm兩種不同粒度的金粉進行了轉化效率試驗，每個處理轉化花藥2000個。結果顯示，0.6μm的金粉轟擊花藥獲得胚狀體652個，陽性植株9個，轉化效率為0.45%；而1.0μm金粉轟擊花藥獲得胚狀體703個，陽性植株5個，轉化效率為0.25%。

2.3不同轟擊距離對轉化效率的影響

在上述參數不變的情況下，設定6cm和9cm兩個轟擊距離，每個處理轟擊花藥2000個。其中轟擊距離為6cm時，獲得胚狀體663個，陽性植株10個，轉化效率為0.50%；而轟擊距離9cm時，獲得胚狀體861個，沒有陽性植株。

根據上述3個試驗獲得的數據，確定金粉粒度0.6μm、每槍金粉用量100μg、轟擊距離6cm、轟擊壓力1300psi為花藥轉化的最佳參數組合。

2.4通氣方式和不同修剪方式對加倍效率的影響

如表2所示，當單倍體植株根和葉都被修剪至3cm左右時，通氣情況下，植株存活率和加倍效率都達到100%；不通氣時，只有76株存活，存活率為84.4%，存活的植株全部加倍。只修剪根部時，兩種情況下的加倍效率與根葉皆剪時沒有明顯差別，分別為99.9%和83.3%。但是，只作修剪葉片而不剪根時，植株的加倍效率明顯降低，兩種情況下的加倍效率分別為62.2%和57.8%。如果根葉都不剪，通氣時的加倍效率為45.6%，不通氣時為44.5%。因此，單倍體的加倍效率受通氣和修剪方式的雙重影響，通氣可以極大提高植株的存活率，修剪可以提高存活植株的加倍率。

2.5不同DMSO濃度和處理時間對加倍效率的影響

將具有2～3個分蘗的單倍體植株的根和葉分別修剪至3cm左右，在含有不同濃度DMSO的0.2%的秋水仙堿溶液中分別加倍處理4、8、12h。如表3所示，DMSO濃度和處理時間對植株的存活率有明顯影響，但對收獲指數影響不明顯。在含有5%DMSO的秋水仙堿溶液中處理4h或8h，單倍體加倍效率均最高，為100%，其中以4h為最佳處理時間；用含1%DMSO的溶液處理12h，加倍效率最低，為62.2%。

3結論與討論

3.1金粉粒度、濃度和轟擊壓力、距離對轉化效率的影響

自基因槍轉化方法發明以來，針對不同作物和組織的轉化參數已經建立[11，12]。就小麥而言，對誘導后愈傷組織的轉化體系已經有了非常系統的研究，金粉粒度1μm、每槍30μg、轟擊距離9cm是幼胚轉化常用的參數[13，14]。本試驗首次對基因槍轉化花藥的參數進行了研究，結果表明金粉粒度0.6μm、每槍100μg、轟擊距離6cm是基因槍轉化花藥的最佳參數。不同組織之間轉化參數的差異，可能與外植體的細胞結構有關。花藥是一個高度發達的器官，外面一層是花藥壁，里面包被著無數微小的小孢子，轉化花藥所產生的單倍體轉基因植株實際上是由小孢子分化產生的。微小的小孢子可能跟粒度微小的金粉顆粒更相配，因此，0.6μm的金粉轉化效率更高。而相對堅硬的花藥壁需要比愈傷組織更大的沖擊力，因此，6cm的轟擊距離、1300psi的轟擊壓力轉化效率更高。

3.2植株修剪方式、通氣、DMSO濃度和處理時間對染色體加倍效率的影響

單倍體誘導和染色體加倍是花藥培養的兩個關鍵步驟。在這一過程中，基因型、培養基、培養環境對誘導效率和再生能力都有非常大的影響，隨后的單倍體加倍過程又受單倍體生長狀態、加倍藥劑的種類和處理方式等多種因素的影響[9]。小麥的花藥培養自20世紀60年代成功以來，已有大量關于提高愈傷誘導效率和單倍體加倍效率的研究，秋水仙堿是應用最為廣泛的加倍劑，通常用法為用0.1%～0.2%的秋水仙堿處理幾個小時，但是加倍效率在不同的報道中差異很大，而且往往伴隨著較高的死苗率[15，16]。DMSO具有穩定細胞骨架、免受外來因素損傷的作用。本試驗中5%DMSO處理提高了植株存活率，進一步證實了DMSO對細胞的保護作用。隨著處理時間的延長，不同濃度DSMO處理的植株存活率均明顯降低，表明秋水仙堿的積累會嚴重影響植株存活率。本試驗結果顯示在含有5%DMSO的0.2%秋水仙堿溶液中，處理根葉均經過修剪的單倍體植株4h，加倍效果最好。

2結果與分析

2.1不同金粉濃度和轟擊壓力對轉化效率的影響

本試驗首先設計3個轟擊壓力和3個金粉濃度，進行9個試驗處理，每個處理轉化花藥2000個，具體結果見表1。

從表1可以看出，在花藥數目相同的情況下，900psi的轟擊壓力下，3個金粉濃度都沒有得到陽性植株；1100psi的轟擊壓力下，每槍金粉用量為60μg時得到3個陽性植株，每槍金粉用量為100μg時，得到5個陽性植株，其轉化效率分別為0.15%和0.25%；而在1300psi的轟擊壓力下，3個濃度的金粉都得到陽性植株，其中每槍用量為100μg時轉化效率最高，達到0.60%。

2.2不同金粉粒度對轉化效率的影響

依據上述試驗數據，確定了1300psi轟擊壓力和每槍100μg的金粉用量為適宜參數，在培養條件和轟擊壓力、金粉濃度等轟擊參數不變的情況下，對0.6μm和1.0μm兩種不同粒度的金粉進行了轉化效率試驗，每個處理轉化花藥2000個。結果顯示，0.6μm的金粉轟擊花藥獲得胚狀體652個，陽性植株9個，轉化效率為0.45%；而1.0μm金粉轟擊花藥獲得胚狀體703個，陽性植株5個，轉化效率為0.25%。

2.3不同轟擊距離對轉化效率的影響

在上述參數不變的情況下，設定6cm和9cm兩個轟擊距離，每個處理轟擊花藥2000個。其中轟擊距離為6cm時，獲得胚狀體663個，陽性植株10個，轉化效率為0.50%；而轟擊距離9cm時，獲得胚狀體861個，沒有陽性植株。

根據上述3個試驗獲得的數據，確定金粉粒度0.6μm、每槍金粉用量100μg、轟擊距離6cm、轟擊壓力1300psi為花藥轉化的最佳參數組合。

2.4通氣方式和不同修剪方式對加倍效率的影響

如表2所示，當單倍體植株根和葉都被修剪至3cm左右時，通氣情況下，植株存活率和加倍效率都達到100%；不通氣時，只有76株存活，存活率為84.4%，存活的植株全部加倍。只修剪根部時，兩種情況下的加倍效率與根葉皆剪時沒有明顯差別，分別為99.9%和83.3%。但是，只作修剪葉片而不剪根時，植株的加倍效率明顯降低，兩種情況下的加倍效率分別為62.2%和57.8%。如果根葉都不剪，通氣時的加倍效率為45.6%，不通氣時為44.5%。因此，單倍體的加倍效率受通氣和修剪方式的雙重影響，通氣可以極大提高植株的存活率，修剪可以提高存活植株的加倍率。

2.5不同DMSO濃度和處理時間對加倍效率的影響

將具有2～3個分蘗的單倍體植株的根和葉分別修剪至3cm左右，在含有不同濃度DMSO的0.2%的秋水仙堿溶液中分別加倍處理4、8、12h。如表3所示，DMSO濃度和處理時間對植株的存活率有明顯影響，但對收獲指數影響不明顯。在含有5%DMSO的秋水仙堿溶液中處理4h或8h，單倍體加倍效率均最高，為100%，其中以4h為最佳處理時間；用含1%DMSO的溶液處理12h，加倍效率最低，為62.2%。

3結論與討論

3.1金粉粒度、濃度和轟擊壓力、距離對轉化效率的影響

自基因槍轉化方法發明以來，針對不同作物和組織的轉化參數已經建立[11，12]。就小麥而言，對誘導后愈傷組織的轉化體系已經有了非常系統的研究，金粉粒度1μm、每槍30μg、轟擊距離9cm是幼胚轉化常用的參數[13，14]。本試驗首次對基因槍轉化花藥的參數進行了研究，結果表明金粉粒度0.6μm、每槍100μg、轟擊距離6cm是基因槍轉化花藥的最佳參數。不同組織之間轉化參數的差異，可能與外植體的細胞結構有關?；ㄋ幨且粋€高度發達的器官，外面一層是花藥壁，里面包被著無數微小的小孢子，轉化花藥所產生的單倍體轉基因植株實際上是由小孢子分化產生的。微小的小孢子可能跟粒度微小的金粉顆粒更相配，因此，0.6μm的金粉轉化效率更高。而相對堅硬的花藥壁需要比愈傷組織更大的沖擊力，因此，6cm的轟擊距離、1300psi的轟擊壓力轉化效率更高。

3.2植株修剪方式、通氣、DMSO濃度和處理時間對染色體加倍效率的影響

單倍體誘導和染色體加倍是花藥培養的兩個關鍵步驟。在這一過程中，基因型、培養基、培養環境對誘導效率和再生能力都有非常大的影響，隨后的單倍體加倍過程又受單倍體生長狀態、加倍藥劑的種類和處理方式等多種因素的影響[9]。小麥的花藥培養自20世紀60年代成功以來，已有大量關于提高愈傷誘導效率和單倍體加倍效率的研究，秋水仙堿是應用最為廣泛的加倍劑，通常用法為用0.1%～0.2%的秋水仙堿處理幾個小時，但是加倍效率在不同的報道中差異很大，而且往往伴隨著較高的死苗率[15，16]。DMSO具有穩定細胞骨架、免受外來因素損傷的作用。本試驗中5%DMSO處理提高了植株存活率，進一步證實了DMSO對細胞的保護作用。隨著處理時間的延長，不同濃度DSMO處理的植株存活率均明顯降低，表明秋水仙堿的積累會嚴重影響植株存活率。本試驗結果顯示在含有5%DMSO的0.2%秋水仙堿溶液中，處理根葉均經過修剪的單倍體植株4h，加倍效果最好。