高效液相色譜法測定橙皮苷磷脂復合物中橙皮苷含量

張 卿，管海燕，金 竹，盧來春

（中國人民解放軍第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所藥劑科，重慶 400042）

高效液相色譜法測定橙皮苷磷脂復合物中橙皮苷含量

張 卿，管海燕，金 竹，盧來春

（中國人民解放軍第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所藥劑科，重慶 400042）

目的 建立測定橙皮苷磷脂復合物中橙皮苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為乙腈-0.5%醋酸水溶液(25∶75)，流速為1.0 mL/min，檢測波長283 nm，柱溫30℃，進樣量20 L。結果 橙皮苷進樣質量濃度在5.19～103.73 g/mL(r=0.999 5)范圍內與峰面積線性關系良好，平均回收率為101.02%(RSD=1.30%)，橙皮苷磷脂復合物中橙皮苷的平均含量為282.5 g/mg。結論 該法準確可靠、重復性好，可用于橙皮苷磷脂復合物的含量測定。

橙皮苷；磷脂復合物；高效液相色譜法；含量測定

橙皮苷是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷，為二氫黃酮衍生物，呈頭發樣針狀晶體，白色或蒼白色，熔點258～262℃，廣泛存在于豆科、唇形花科、蝶形花科、蕓香科、柑橘屬植物中，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調節免疫力、防輻射、保護心血管系統等藥理活性[1]。但其水溶性和脂溶性差，口服絕對生物利用度低[2]。口服給藥是大多數藥物最好的給藥途徑，可以提高患者的順應性，且經濟、安全，但許多有前景的脂溶性或水難溶性藥物生物利用度低[3]。因此，選用合適的載體和制劑技術改善其理化性質，提高與胃腸道黏膜的親和性和透過性等，是促進其口服吸收的有效途徑[4]。將中藥活性成分與磷脂制成磷脂復合物后，可明顯增加中藥活性成分的吸收，提高其生物利用度，增強其藥理效應[5]。為此，本研究中制備了橙皮苷磷脂復合物，并建立了測定其含量的高效液相色譜(HPLC)法。

1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；sartorius BT 25S型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；磁力攪拌器（上海江星儀器有限公司）；FD-1C型冷凍干燥機(北京德天佑科技發展有限公司)。橙皮苷原料藥（含量為95.5%，批號為20131214），橙皮苷標準品（含量為98.79%，批號為20130413），均購自大連美侖生物技術有限公司；大豆卵磷脂（上海太偉藥業有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純；水為雙蒸水；其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.5%醋酸水溶液(25∶75)；檢測波長：283 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2 樣品制備[6]

取處方量的橙皮苷和大豆卵磷脂，加入二甲亞砜(DMSO)-甲醇混合溶液作為反應溶劑，50℃下攪拌1 h，-80℃預凍，然后冷凍干燥除去反應溶劑，即得到橙皮苷磷脂復合物。經紅外光譜(IR)、差示掃描量熱(DSC)分析，證明該復合物是橙皮苷和磷脂通過物理作用結合在一起的。

2.3 方法學考察

專屬性考察：稱取橙皮苷對照品，精密稱定，溶于DMSO-甲醇混合溶液10 mL，再取上述溶液0.5 mL，溶于甲醇10 mL制成質量濃度為97.9 mg/L的對照品溶液。同樣方法制備處方量的大豆卵磷脂溶液和橙皮苷磷脂復合物溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果顯示，大豆卵磷脂不干擾橙皮苷的測定，符合系統適用性要求，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：稱取 10.5 mg橙皮苷標準品，精密稱定，置100 mL容量瓶內，加甲醇溶解并定容，得橙皮苷貯備液。精密吸取橙皮苷貯備液，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，分別制得質量濃度為5.2，10.4，20.8，41.5，51.9，83.0，103.7 μg/mL的系列溶液。取上述系列溶液，分別按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以進樣質量濃度為橫坐標、橙皮苷峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y=23.12 X-1.89(r=0.999 5)。結果表明，橙皮苷進樣質量濃度在5.19～103.73 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為51.9 μg/mL的橙皮苷貯備液，按擬訂色譜條件連續進樣 5次，測定峰面積。結果的 RSD= 0.23%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批號樣品，平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的 RSD為1.59%（n=6），表明方法重復性良好。

回收試驗：取約12，15，18 mg的橙皮苷標準品，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入處方量的大豆卵磷脂，用DMSO-甲醇混合溶液溶解并定容。分別按擬訂色譜條件進樣測定，以外標法計算。結果見表1。

表1 橙皮苷回收試驗結果（n=9）

2.4 樣品含量測定

精密稱取橙皮苷磷脂復合物(相當于橙皮苷30 mg)，置10 mL容量瓶中，加DMSO-甲醇混合溶液溶解并定容，12 000 r/min離心10 min，精密量取0.5 mL續濾液置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，作為供試品溶液。按擬訂色譜條件進樣測定，以外標法計算含量。取樣品3批，制備成供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積，計算橙皮苷的含量。結果3批樣品中橙皮苷的平均含量為282.5 μg/mg。

3 討論

參照2010年版《中國藥典(一部)》橙皮苷的含量測定方法，其流動相為甲醇-醋酸-水（35∶4∶61），結果分離度不好。分別比較了甲醇-0.5%醋酸水溶液、乙腈-0.5%醋酸水溶液、乙腈-5 mmol/L醋酸銨溶液的分離效果，結果表明，以乙腈-0.5%醋酸水溶液為流動相時分離度、峰形、理論板數較好。根據出峰時間調整流動相比例，最終選擇乙腈-0.5%醋酸水溶液（25∶75）作為流動相。

本試驗中建立了測定橙皮苷磷脂復合物中橙皮苷含量的HPLC法，在擬訂色譜條件下，輔料、溶劑對測定無干擾，結果準確，方法重復性好，可有效控制該制劑的質量，為進一步研制橙皮苷口服制劑奠定了基礎。

[1]錢俊臻，王伯初.橙皮苷的藥理作用研究進展[J].天然產物研究與開發，2010，22(1):176-180.

[2]凡小燕，李 俊，王 雯，等.橙皮苷自微乳在大鼠小腸的吸收動力學[J].安徽醫科大學學報，2011，46（8）:754-758.

[3]Pinnamaneni S，Das NG，Das SK.Formulation approaches for orally administered poorly soluble drugs[J].Pharmazie，2002，57（5）:291-300.

[4]江 波，印春華.提高難溶性藥物口服生物利用度的方法[J].中國醫藥工業雜志，2002，33（7）:358-362.

[5]孫 燕，高 爾，王汝琴.中藥活性成分磷脂復合物研究進展[J].醫學綜述，2007，13（11）:875-877.

[6]張 穎，李 楠，王彩云，等.HPLC測定鮭魚降鈣素磷脂復合物的含量[J].華西藥學雜志，2013，28（6）:623-625.

Determination of Hesperidin Content in Hesperidin-Phospholipid Complex by HPLC

Zhang Qing,Guan Haiyan,Jin Zhu,Lu Laichun (Department of Pharmacy,Research Institute of Field Surgery,Daping Hospital of Third Military University,Chongqing,China 400042)

Objective To establish a HPLC method for the content determination of hesperidin-phospholipid complex.M ethods The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with a mobile phase of acetonitrile-0.5% acetic acid aqueous solution(25∶75).The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 283 nm.The column temperature was maintained at 30℃ and the inject volume was 20 μL.Results Hesperidin in the range of 5.19-103.73 μg/mLshowed the good linear relation(r=0.999 5).The average recovery rate was 101.02%(RSD=1.30%).The average content of hesperidin contained in hesperidin-phospholipid complex was 282.5 μg/mg.Conclusion The established method in this study is accurate,reliable and reproducible,and can be used for the content determination of hesperidin-phospholipid complex.

hesperidin;phospholipid complex;HPLC;content determination

張卿，碩士研究生，藥師，主要從事中西藥物新型給藥系統研究，（電話）023-68757098（電子信箱）zhangqingzq023＠163.com；盧來春，博士研究生，副主任藥師，主要從事創新藥物及制劑的研究，本文通訊作者，（電話）023-68757091（電子信箱）lulaicq＠163.com。

2014-11-13)

重慶市衛生局中醫藥科技項目，項目編號:ZY20132058。

R284.1；R282.71

A

1006-4931(2015)13-0030-02