HPLC-MS/MS法測定犬體內鹽酸苯環壬酯的血藥濃度及其藥動學研究Δ

曾 媛，鄭露露，熊 磊，劉 輝#，段 婷（.廣州軍區武漢總醫院藥劑科，武漢 430070；.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065）

鹽酸苯環壬酯（PCH）是我國軍事醫學科學院毒物藥物研究所發明的新一代高選擇性中樞抗膽堿能抗暈動病Ⅰ類新藥[1-2]，擁有中國專利2項和英美專利各1項。其制劑鹽酸苯環壬酯片用于暈動病的防治，具有療效可靠、中樞不良反應小的優點[3-5]。由于其給藥劑量小（2 mg/d），此劑量下，鹽酸苯環壬酯的血藥濃度極低[6]，因此需要建立簡單快速、選擇性強且靈敏度高的方法用于血藥濃度檢測。本研究采用高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS/MS）法建立了鹽酸苯環壬酯片在Bealge犬體內的血藥濃度測定方法，為鹽酸苯環壬酯緩釋制劑的開發與臨床前研究提供了可靠保證。

1 材料

1.1 儀器

1260 型HPLC 系統，包括二元高壓泵系統、自動進樣器和切換閥（美國Agilent 公司）；API3200 型三重四極桿串聯質譜儀，包括電噴霧離子化源（美國AB Sciex公司）；Anke TGL-16B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸苯環壬酯對照品（批號：100716-200501，純度：100%）、鹽酸戊乙奎醚對照品（批號：100931-201101，純度：100%）購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸苯環壬酯片（北京華素制藥股份有限公司，批號：13082916，規格：每片2 mg）；乙腈、甲酸為色譜純，水為雙重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流動相：乙腈-0.01%甲酸水溶液（60∶40，V/V），流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。

2.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI 源），正離子方式檢測，采用選擇性多反應離子監測模式（MRM）同時測定苯環壬酯和內標戊乙奎醚，掃描時間0.2 s。氣簾氣（CUR）：25 psi；霧化器（GS1）：40.0 psi；輔助加熱器（GS2）：55 psi；碰撞氣（CAD）：5.0 psi；離子噴霧電壓（IS）：5 500.00 V，離子源溫度（TEM）：600 。離子去簇電壓（DP）：61 V（苯環壬酯）、70 V（戊乙奎醚）；入口電壓（EP）：11 V（苯環壬酯）、10 V（戊乙奎醚）；碰撞能量（CE）：45 eV（苯環壬酯）、55 eV（戊乙奎醚）；用于定量分析的離子反應分別為m/z358.3→m/z156.1（苯環壬酯）、m/z316.1→m/z128.1（戊乙奎醚）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 鹽酸苯環壬酯標準溶液 精密稱取鹽酸苯環壬酯對照品10 mg，置于100 ml 量瓶中，加乙腈適量，振搖使溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得100μg/ml 的鹽酸苯環壬酯貯備液。取該貯備液1 ml，置于100 ml 量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，得1μg/ml的鹽酸苯環壬酯對照品溶液。取上述對照品溶液，以乙腈依次倍比稀釋，制備成質量濃度分別為150、100、50、10、5、1 ng/ml 的鹽酸苯環壬酯標準溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.3.2 內標溶液 精密稱取鹽酸戊乙奎醚對照品10 mg，置于100 ml量瓶中，加乙腈適量，振搖使溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得100μg/ml鹽酸戊乙奎醚貯備液。取該貯備液適量，加乙腈倍比稀釋至250 ng/ml，作為內標溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.4 血漿樣品處理

取血漿樣品200 μl，加入20μl內標溶液（250 ng/ml），渦漩混勻；再加入400 μl 乙腈，渦旋30 s 后，以離心半徑3 cm（下同）、10 000 r/min 離心5 min，取上清液10μl，進行HPLC-MS/MS定量分析。

2.5 方法專屬性考察

分別取鹽酸苯環壬酯貯備液和鹽酸戊乙奎醚貯備液，首先經Q1掃描選擇母離子，然后進行二級質譜掃描。根據質譜圖分析結果，進行MRM 掃描：苯環壬酯為358.3/156.1（m/z），內標戊乙奎醚為316.1/128.1（m/z）。取空白血漿、空白血漿+鹽酸苯環壬酯對照品溶液+內標溶液、犬給藥后15 min的血漿樣品+內標溶液，按“2.4”項下方法處理后，進行HPLC-MS/MS法分析。結果，空白血漿中內源性雜質和代謝物不干擾鹽酸苯環壬酯及內標的測定，鹽酸苯環壬酯和內標的保留時間分別為0.692、0.634 min。MRM色譜圖見圖1。

圖1 MRM色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+鹽酸苯環壬酯+內標；C.血漿樣品+內標；1.內標；2.鹽酸苯環壬酯Fig 1 MRM chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+PCH+internal standard；C.plasma sample+internal standard；1.internal standard；2.PCH

2.6 標準曲線和定量限考察

取空白血漿180 μl，共12份，加入“2.3.1”項下的鹽酸苯環壬酯標準溶液20 μl，制備成鹽酸苯環壬酯的質量濃度為15.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 ng/ml 的質控樣品，按“2.4”項下方法處理，每一濃度進行雙樣本分析，進樣10μl，記錄色譜。以鹽酸苯環壬酯和內標峰面積比值（y）為縱坐標、鹽酸苯環壬酯質量濃度（x）為橫坐標，用加權最小二乘法（權重系數：1/c2）進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.995 3x+0.066 1（r＝0.999 6）。結果，鹽酸苯環壬酯檢測質量濃度的線性范圍為0.1～15.0 ng/ml，定量限為0.1 ng/ml（信噪比為10）。

2.7 回收率與精密度試驗

取空白血漿180 μl，按“2.6”項下方法制備鹽酸苯環壬酯質量濃度分別為12、7、0.3 ng/ml 的質控樣品，各5 份，按“2.4”項下方法處理，進樣獲得相應色譜峰面積。以其與已知濃度比較計算方法回收率，以其與標準溶液比較計算提取回收率；同一批時間內完成血漿樣品處理測定5次考察批內精密度，連續測定3批考察批間精密度。回收率與精密度試驗結果見表1。

表1 回收率與精密度試驗Tab 1 Results of extraction and precision tests

2.8 血漿樣品穩定性考察

取－80 ℃保存0、7、14、21、28 d的血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，測定其濃度；同法測定反復冷凍-解凍循環3次的血漿樣品和處理后再室溫放置0、2、4、8、12、24 h 的血漿樣品。結果，鹽酸苯環壬酯血漿樣品在－80 ℃條件下能穩定保存28 d（RSD＝7.2%，n＝5）；反復凍融3 次并不影響血藥濃度測定（RSD＝8.9%，n＝3）；處理后的血漿樣品在室溫條件下能穩定保存24 h（RSD＝5.6%，n＝6）。

2.9 基質效應考察

取空白血漿180μl，共6 份，加入400 μl 乙腈沉淀蛋白后，分別加入鹽酸苯環壬酯標準溶液和內標溶液，制備成鹽酸苯環壬酯質量濃度為12、7、0.3 ng/ml，內標質量濃度為23 ng/ml的對照血漿，按“2.4”項下方法處理后，進行HPLC-MS/MS 法分析獲得峰面積。以其與相應質量濃度的鹽酸苯環壬酯標準溶液和內標溶液的混合溶液直接進樣獲得的峰面積之比評價基質效應，比值均在90%～110%之間，表明本試驗建立的鹽酸苯環壬酯測定方法不受基質效應的影響。

2.10 藥動學研究

取犬6 只，實驗前1 d 晚8 點開始禁食，實驗當天早上8 點分別ig 鹽酸苯環壬酯片2 mg 和4 mg。給藥后2 h 內禁水，給藥4 h 后正常進食進水。給藥和實驗期間盡量避免犬劇烈運動，食物為低脂肪標準餐。于給藥前5 min 和給藥后0.17、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、24、36 h時用肝素化真空采血管取前肢靜脈血2 ml，4 000 r/min離心10 min，按“2.4”項下方法處理后，采用HPLC-MS/MS 法測定鹽酸苯環壬酯的血藥濃度。2 周后交叉給藥同法測定血藥濃度。利用DAS2.0 軟件按一級吸收二室模型計算藥動學參數。犬血漿中鹽酸苯環壬酯的藥-時曲線見圖2；藥動學參數見表2（表中“＊”表示高于定量上限濃度的樣品采用相應的空白血漿稀釋后重新測定的濃度）。

圖2 犬血漿中鹽酸苯環壬酯的藥-時曲線（n＝6）Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of PCH in the plasma of dogs（n＝6）

表2 鹽酸苯環壬酯片在犬體內的藥動學參數（，n＝6）Tab 2 The pharmacokinetic parameters of PCH tablets in dogs（，n＝6）

表2 鹽酸苯環壬酯片在犬體內的藥動學參數（，n＝6）Tab 2 The pharmacokinetic parameters of PCH tablets in dogs（，n＝6）

犬ig 鹽酸苯環壬酯片劑2 mg 和4 mg 后，藥動學參數tmax、t1/2α、t1/2β、MRT0-36h經t檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05），表明藥物的吸收、分布、消除不受劑量影響；AUC0-36h、cmax經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），并與服藥劑量的倍增一致。此結果與人口服鹽酸苯環壬酯片劑2 mg和4 mg的研究[7]相符。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本實驗中測定的鹽酸苯環壬酯為外消旋體，因R-鹽酸苯環壬酯、S-鹽酸苯環壬酯在有機相比例較低的情況下易于色譜分離，因此采用較高的有機相比例。此時分析物和內標能達到色譜分離目的，但分析物峰形拖尾明顯，保留時間較長（＞5 min）。在水相中添加一定比例的甲酸，有利于正離子質子化，維持樣品在流動相中的電離狀態，此時分析物和內標的峰形得到改善，具有很好的對稱性，且分析時間縮短至0.7 min。最終優化確定流動相為乙腈-0.01%甲酸水溶液（60∶40）。

3.2 內標的選擇

本文建立的HPLC-MS/MS 法對于內標與鹽酸苯環壬酯、與雜質的色譜分離要求更高。實驗中曾篩選了硫酸阿托品、硝酸毛果蕓香堿、鹽酸戊乙奎醚等多個內標候選物[8-9]，綜合保留時間、雜質干擾因素，最終選擇鹽酸戊乙奎醚為內標。

3.3 方法的選擇

在臨床前研究鹽酸苯環壬酯代謝時，曾采用過放射性同位素分析方法和放射受體分析方法，其給藥劑量分別為1 mg/kg和0.5 mg/kg，檢測靈敏度僅為5 ng/ml[10]。筆者建立了一種靈敏度高、選擇性強的HPLC-MS/MS 法用于Beagle 犬血漿樣品中鹽酸苯環壬酯的定量分析，方法靈敏度達到了0.1 ng/ml，滿足鹽酸苯環壬酯在Beagle犬體內藥動學研究的要求。

本方法采用鹽酸戊乙奎醚為內標，較之同位素標記的內標物更容易獲得也更價廉，具有可推廣性；采用乙腈直接沉淀蛋白，簡化了實驗步驟，縮短了測定時間，有利于實現大批量樣本的快速分析。筆者應用此方法進行了不同給藥劑量的鹽酸苯環壬酯片口服給藥后Beagle犬體內藥動學研究。在各分析批次樣品中均勻隨機放置高、中、低3 個濃度的質控樣品，以此監控分析過程的有效性和準確性。結果顯示，質控合格率為98%。

對于本研究結果中出現某些藥動學參數s大于x的現象，考慮是由于試驗樣本量（n＝6）少、實驗對象存在個體差異造成的。在后期研究過程中，將通過增加樣本量來避免此類問題的出現。

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