響應面法優化S2菌株的培養條件*

劉江紅，任靜薇，賈云鵬，楊林峰，于 博，李 航

(1.東北石油大學 化學化工學院 石油與天然氣化工省重點實驗室,黑龍江 大慶 163318；2.大港油田 石油工程研究院,天津 300280；3.大慶 城市排水公司，黑龍江 大慶 163318；4.東北石油大學 數學與計算機學院,黑龍江 大慶 163318)

響應面法優化S2菌株的培養條件*

劉江紅1?，任靜薇1，賈云鵬2，楊林峰3，于 博1，李 航4

(1.東北石油大學 化學化工學院 石油與天然氣化工省重點實驗室,黑龍江 大慶 163318；2.大港油田 石油工程研究院,天津 300280；3.大慶 城市排水公司，黑龍江 大慶 163318；4.東北石油大學 數學與計算機學院,黑龍江 大慶 163318)

利用快速篩選方法從大慶采油三廠油田采出水中篩選出高產生物表面活性劑菌株S2，經鑒定為芽孢桿菌屬.對S2菌株產生的生物表面活性劑進行提取及純化后，通過離子鑒別實驗及紅外光譜法對其進行定性檢測，確定其種類為非離子型脂肽類.以菌種S2產生的發酵液的乳化指數(E24)為指標，通過響應面優化方法對S2菌株的培養條件進行優化，以接種量、pH值、溫度、搖床轉速為因素優化對象進行實驗.在此模型的基礎上，通過二次回歸方程得出最佳值是pH為7.2、溫度為43.5 ℃ 、接種量為5.2%(V/V)、搖床轉速為162 r/min.在優化后的最佳培養條件下，測得菌株S2所產生發酵液的最優E24為81.20%.

發酵液；紅外光譜法；響應面實驗；乳化；菌株

生物表面活性劑是微生物在一定條件下發酵產生且具有表面活性的次級代謝產物，其性質為同時具有親油性和親水性[1].生物表面活性劑對疏水性物質具有有效的乳化、潤濕、分散、溶解作用，同時使體系的表/界面張力有所下降[2-3].自然界中存在許多微生物(細菌、真菌等)，這些微生物能夠在發酵培養過程中分泌產生不同種類的生物表面活性劑.現在化學合成的表面活性劑因其造成環境污染而使其使用面臨著巨大的環境壓力，生物表面活性劑具有功能的多樣性和對環境的友好性，且在食品工業、原油采出、污染環境的修復等領域中起著越來越重要的作用.

作為一種綜合性優化方法，響應面優化法結合了數學方法和統計學方法，主要內容包括優化實驗設計、響應曲面分析和擬合優化計算3部分，被廣泛地應用在微生物培養條件優化和生化反應中[4].本實驗通過Box-Behnken響應面設計的應用對生物表面活性劑高產量菌株S2的發酵培養條件進行優化，以乳化指數E24為響應值，pH值、溫度、接種量及搖床轉速為其主要影響因素，通過實驗后得到的數據并分析各因素的最佳條件，從而提高乳化指數.通過對本實驗模型的3D響應曲面圖和等高線圖的分析，可以直觀地得出各因素與乳化指數E24的響應關系及各因素間交互作用的顯著程度[5-6].采用Design-Expert 8.0.5軟件進行實驗設計、數據處理及模型建立.

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 主要設備

XZD-3型界面張力儀，上海平軒科學儀器有限公司；超聲細胞破碎儀，賽飛(中國)有限公司；薄層色譜層析缸(100×100)，天津市思利達科技有限公司 ；紅外光譜儀，大塚電子(蘇州)有限公司.

1.1.2 菌株來源

以快速法為篩選方法，從大慶采油三廠的油田采出水中篩選出高產生物表面活性劑純菌種S2，經實驗室一系列生理、生化實驗鑒定后，確定S2菌種為芽孢桿菌屬(Bacillussp.).

1.1.3 培養基

發酵培養基(g/L)：葡萄糖20 g，mNaNO3=0.5 g，mKH2PO4=1 g，mNa2HPO4=2 g，mMgSO4=0.02 g，mFeSO4=0.01 g，mNaCl=5 g，mCaCl2=0.08 g，pH值為7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min.

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液的乳化指數(E24)測定[7]

將經過72 h震蕩培養后的發酵液用離心機去除菌體細胞，取其5 mL和5 mL液體石蠟混合于比色管中，在100 W的超聲波中進行細胞粉碎處理，待形成白色乳化液后，靜置24 h，測量E24的公式如式(1)所示.

(1)

1.2.2 發酵液的表面張力測定

采用Wihelmy板法對菌株的發酵液進行表面張力測定.移取發酵液10 mL置于直徑為4 cm的培養皿中，發酵液的表面張力被表面張力測定儀測定，在每次測定前，需將鉑片用蒸餾水沖洗干凈，并用酒精燈對鉑片進行灼燒.以蒸餾水做空白實驗.

1.2.3 生物表面活性劑提取、純化

本實驗采用酸沉淀法進行表面活性劑純化.將S2菌株發酵液在10 000 r/min的轉速下離心20 min后取其上清，上清液用濃鹽酸(2 mol/L)調節至pH為2.0，在溫度為4 ℃靜置過夜.靜置后的溶液在相同轉速下繼續離心20 min，棄其上清，用少量蒸餾水重懸沉淀，用濃NaOH調節至pH為7.0，樣品于-20 ℃放置5 h后，在真空條件下冷凍干燥24 h.所得的樣品即為該生物表面活性劑的粗品，將其稱重后用無水甲醇進行超聲溶解，在14 000 r/min的轉速下離心10 min后，取其上清并在46 ℃下進行旋轉蒸發.

1.2.4 生物表面活性劑的定性鑒別實驗

通過亞甲基藍-氯仿法、酸性溴酚藍法及濁點法對提純后的生物表面活性劑進行離子鑒別實驗.

用KBr壓片法把經過甲醇萃取得到的生物表面活性劑純品壓片，利用紅外吸收光譜對其進行測定.紅外吸收光譜上出現吸收峰對應的波長范圍可用來判斷其相應的官能團，進而確定該樣品的分子結構.

1.2.5 響應面實驗設計

根據Box-Behnken實驗設計原理，進行4因素3水平(分別以-1，0，+1編碼)的響應面分析實驗，各因素的實驗水平及編碼如表1所示.29組實驗對應的29個實驗點可以分為析因點和零點，為了更好地估算實驗中可能存在的誤差，需要重復進行5次零點實驗.

Box-Behnken優化實驗中具體的實驗點設置如表2所示.通過實驗數據的二次回歸擬合分析得到各因素與響應值間的回歸方程，分析各因素與響應值間的主效應、因素間的交互效應得到最佳響應值.

表1 Box-Behnken實驗因素水平及編碼

表2 Box-Behnken實驗點設計及實驗結果

2 結果與討論

2.1 生物表面活性劑的定性鑒別實驗

2.1.1 生物表面活性劑的離子鑒別實驗

觀察實驗現象為陰離子鑒別實驗中氯仿層顯無色，陽離子鑒別實驗中溶液不變色，非離子鑒別實驗中溶液內有新相生成.通過上述實驗結果可知S2菌株所產生物表面活性劑種類為非離子型.

2.1.2 紅外光譜分析

由圖1分析可知，生物表面活性劑在3 300 cm-1～3 200 cm-1有一個較寬的吸收峰，其分子具有鍵C-H和N-H的伸縮振動，表示該物質是含有氨基的碳氫化合物并且存在分子內氫鍵.此外在2 927 cm-1,2 896 cm-1和2 358 cm-1處有3個較強吸收峰，表示該物質含有C-CH3鍵或是含有長烷基.在6 654 cm-1處擁有最強吸收峰，表示該生物表面活性劑分子含有肽鍵，分子內的C=O鍵伸縮振動引起與此處相鄰的1 532 cm-1的另一強吸收.由紅外譜圖可知，S2菌株發酵產生的生物表面活性劑具有與脂肽類基本一致的特征吸收峰.

波數/cm-1

2.2 實驗結果與模型分析

應用Design Expert軟件對表2的實驗數據進行二次多元回歸擬合，分析后得到4個因素與乳化指數E24之間的二次擬合回歸方程(A：pH值，B：溫度，C：接種量，D：搖床轉速)：

Y(E24)=-675.78+126.81A+9.23B+

12.39C+0.80D-0.001 7AB-0.11AC+

0.001 6AD-0.002 5BC+0.000 3BD+

0.017CD-8.77A2-0.11B2-1.37C2-

0.002 8D2．

(2)

由表3可看出，本實驗所選用模型的P值<0.000 1具有高度的顯著性；該模型的單因素中A(pH值)、B(溫度)、C(接種量)對響應值(E24)的影響顯著，FpH= 340.24 >F溫度= 142.33 >F接種量= 6.66 >F搖床轉速= 0.35，二次項A2,B2,C2和D2的影響也十分顯著.該模型的失擬率僅為0.01%，表明分析得到的回歸方程符合實驗實際情況，可用該方程代替真實函數對實驗結果進行預測和探究.

表3 回歸模型的方差分析

表4 回歸模型的可信度分析

2.3 菌種培養條件的優化

利用軟件對表2的實驗數據進行二次多元回歸擬合后，得到本實驗模型的3D響應曲面及等高線圖，通過分析研究可以得到各因素之間的交互作用并且確定其最優值.兩因素間交互作用的顯著程度被等高線圖直觀地反映出，即交互作用顯著呈橢圓形，不顯著呈圓形.故由等高線圖可知pH值和接種量、pH值和搖床轉速、溫度和搖床轉速、溫度和接種量、接種量和搖床轉速兩因素的交互作用顯著.

由圖2中的3D響應曲面可知，A，B，C和D存在極值點，利用Design Expert軟件，對乳化指數E24(Y)的二次多項式模型解逆矩陣可知，響應值Y越大越好.經軟件分析或回歸方程求導得到優化結果，可得A，B，C和D對應實驗值A=7.2，B=43.5 ℃，C=5.2%，D=162 r/min.在此培養條件下，分析后響應值Y達最大值，預測Ymax=78.86%.

(a) 3D響應曲面圖

(b) 等高線圖

2.4 追加實驗

在響應面分析得到的S2菌株最佳培養條件下進行追加實驗，通過追加實驗測得：由S2菌產生的生物表面活性劑的最佳E24為81.20%，較Abouseoud[8]得到的65%與Ansari[9]得到的70%有了很大的提高；S2菌株產生的生物表面活性劑的最佳產量為1.26 g/L(不在最佳條件下測得生物表面活性劑產量為0.72 g/L)；S2菌株的發酵液的表面張力從72.0 mN/m減少至25.8 mN/m.

3 結 論

通過離子鑒別實驗及傅里葉紅外光譜分析法對高產生物表面活性劑菌株S2產生的生物表面活性劑進行定性檢測，確定其為非離子型脂肽類.采用響應面法進行了S2菌株發酵培養條件的優化實驗，通

過Box-Behnken實驗設計和Design Expert 8.0.5軟件分析確定出主要影響因素的最優值，即pH為7.2、溫度為43.5 ℃、接種量為5.2%(V/V)、搖床轉速為162 r/min.由因素實驗水平和顯著性分析可知，pH值、溫度、接種量對S2菌株產生發酵液的乳化指數E24有顯著影響，其中pH值對其影響最大.在最佳培養條件下，S2菌株所產生物表面活性劑的最佳E24為81.20%、生物表面活性劑的產量從0.72 g/L增加至1.26 g/L、發酵液的表面張力從72.0 mN/m減少至25.8 mN/m.模型的實驗值接近回歸方程計算得到的預測值，說明該回歸方程能夠反映實際情況中各因素對響應值的影響，故采用響應面法優化S2菌株的培養條件具有高效性和可行性.

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Optimization of Culture Conditions of S2 Strain by Response Surface Method

LIU Jiang-hong1?, REN Jing-wei1, JIA Yun-peng2, YANG Lin-feng3, YU Bo1,LI Hang4

(1. Provincial Key Laboratory of Oil and Gas Chemical Technology, College of Chemistry and Chemical Engineering, Northeast Petroleum Univ, Daqing ，Heilongjiang 163318 China；2.Research Institute of Petroleum Engineering, Dagang Oilfield,Tianjin 300280 China；3.Daqing Urban Drainage Company, Daqing, Heilongjiang 163318, China；4.College of Mathematics and Statistics, Northeast Petroleum Univ， Daqing， Heilongjiang 163318,China )

S2 strain that highly produces biosurfactant was screened from the oilfield water of three plants in Daqing Oilfield in the rapid screening method, and the S2 strain was identified as Bacillus sp.. Through FT-IR and ion identification test, S2 biosurfactant was identified as nonionic lipopeptide biosurfactant. This experiment treated emulsification index (E24) of S2 strain fermentation broth as the object. Through response surface optimization method, the culture conditions (inoculum, pH, temperature and rotation speed) of the S2 strain were optimized. On the basis of response surface model, the optimum pH value was 7.2 and the temperature was 43.5 ℃, inoculation of 5.2% (V/V), rotation speed was 162 r/min through the quadratic regression equation. Under the optimal condition, the bestE24of S2 strain fermentation broth was 81.20%．

fermentation broth; infrared spectral measurements; response surface experiments; emulsification; strain

1674-2974(2015)06-0096-05

2014-06-30

黑龍江省教育廳科技公關項目(12531064)

劉江紅(1966-)，女，黑龍江綏化人，東北石油大學教授

?通訊聯系人，E-mail:ljhread@126.com

TE357

A