熱誘導表達的水稻OsBBX30基因克隆和表達分析*

饒力群，劉蘭蘭,汪啟明， 帥 進, 彭 澎, 李夢云，唐世偉

(湖南農業大學 生物科學技術學院， 湖南 長沙 410128)

熱誘導表達的水稻OsBBX30基因克隆和表達分析*

饒力群，劉蘭蘭,汪啟明?， 帥 進, 彭 澎, 李夢云，唐世偉

(湖南農業大學 生物科學技術學院， 湖南 長沙 410128)

生物信息學分析表明：OsBBX30基因啟動子含有與逆境相關的作用元件HSE．為進一步了解OsBBX30基因在生物體內受熱誘導，通過OsBBX30基因克隆構建原核表達和實時定量PCR分析，證實OsBBX30基因表達受熱脅迫誘導，能增強大腸桿菌的耐熱能力，為深入了解該家族基因和挖掘水稻耐熱基因奠定基礎.

克隆；水稻BBX基因；熱脅迫；實時定量PCR

水稻是我國重要糧食作物，高溫是制約水稻生產和產量的重要因素，培育耐熱水稻品種是保證水稻穩產的重要手段[1]，而利用基因工程技術是獲得水稻耐熱新品種的重要途徑[1]，因此篩選和克隆水稻耐熱相關的基因受到人們關注.

鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，在基因表達、細胞分化、胚胎發育、增強抗逆性等方面具有重要的調控作用[2]，對植物的生物發育和脅迫的響應是至關重要的[3]，在光調節植物生長發育中也是不可替代的[4-5].BBX是一類含有B-box結構域的鋅指蛋白，通過生物信息學分析發現，在水稻中有30個BBX基因，擬南芥中有32個BBX基因[6-8].其中B-box家族中有一類只在N端具有多個B-box結構域，在C端不具有CCT結構的鋅指蛋白，稱為DBB (Double B-box)蛋白亞族基因.擬南芥DBB亞家族中有8個編碼基因，通過比對發現水稻中有10個OsDBB同源基因[6].擬南芥中該亞家族基因參與調控擬南芥光形態建成、光周期調控開花時間，花的發育、耐熱，而在水稻中關于該亞家族基因的功能還未有報道[7].

本研究對OsDBB亞家族中的OsBBX30進行耐熱相關的生物信息學分析和運用實時定量PCR技術檢測其在不同水稻品種中響應熱脅迫的表達特征，并通過構建含OsBBX30蛋白的大腸桿菌菌株和分析其對大腸桿菌耐熱能力的影響，明確OsBBX30基因響應熱脅迫的表達特征，為深入了解其在生物響應熱脅迫信號途徑中的作用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材 料

水稻材料為國家雜交水稻中心提供的水稻品種日本晴( Oryz asativa L ssp．)，9311，N22，種植于湖南農業大學人工氣候室，水稻生長至幼穗分化期(6期末7期初)，分別以0 h，3 h，6 h和12 h在42 ℃進行熱處理.

1.1.2 菌株、質粒與試劑

大腸桿菌菌株DH5αpGEM-T vector，Taq酶和Marker 以及DNA快速純化回收試劑盒，購于天根生化材料(北京)有限公司，質粒PET-30a由本實驗室保存所得，DNA限制性內切酶，反轉錄試劑盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)購于長沙海洋生物技術有限公司(Fermentas公司代理)， RNA Simple Total RNA Kit購于北京天根生化科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒[UltraSYBR Mixture(with ROX)]購于康為世紀.

1.2 方 法

1.2.1 生物信息學網站介紹

RMAP(http://www.ricemap.org/index.jsp)——a new-generation rice genome browser，即RMAP數據庫，該數據庫收錄了全稻屬基因組圖譜，且從該網站中可以查找目的基因的全長基因組序列、CDS以及潛在的啟動子序列.

PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)——Cis-Acting Regulatory Element，植物順式作用元件數據庫，從該網站中可以分析植物中已知基因的啟動子區含有的順式作用元件.

String (http://www.string-db.org/)——functional protein association networks，蛋白相互作用數據庫,通過已知的蛋白序列查找同源蛋白和相互作用分析.

1.2.2 生物信息學分析

通過NCBI(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)網站搜尋到其核酸序列，再利用Rice-map(http://www.ricemap.org/index.jsp)對水稻OsBBX30基因的結構特征進行分析，并對其啟動子區域在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網站上進行順式作用元件分析.通過String (http://www.string-db.org/)網站進行蛋白同源性和相互作用分析，最后在ROAD (http://ricearray.org/index.shtml)網站對水稻OsBBX30基因進行基因生物芯片分析.

1.2.3 載體克隆

采用天根生化科技(北京)有限公司RNA提取試劑盒的方法提取水稻日本晴葉片的RNA.利用GenBank中水稻基因組序列獲得OsBBX30基因的CDS序列，并利用Primer Premier5.0設計特異的克隆引物:F(5′to3′): TCCTTGTAGTCCCGCGGATGAGGATCCAGTGCGACG，R(5′to3′): AGGATCCCGGGTACCTCATCCAAGATCAGAACG AT在正向引物和反向引物的5'分別引入EcoRI 和HindIII酶切位點.50 μL的反應體系為：1 μL EasyTaq；5 μL 10*buffer；前后引物各1 μL；5 μL cDNA；33 μL ddH2O；4 μL dNTP；PCR反應體系為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環；最后72 ℃延伸5 min.PCR產物用質量分數為1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.利用DNA純化試劑盒切膠回收目的片段，將目的片段與T載體鏈接，通過熱激法將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中.37 ℃過夜培養后，挑取單菌落進行PCR，并提取陽性克隆的重組質粒進行酶切驗證.陽性克隆由鉑尚生物技術有限公司測序.

將目的片段從T載體上經EcoRI 和HindIII切下回收后，與用內切酶EcoRI 和HindIII酶切純化后的PET-30a載體，去磷酸化后進行連接，用熱激法轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，經驗證為重組的表達載體.

1.2.4 大腸桿菌耐熱性分析

融合蛋白誘導表達：先挑BL21/30a-OsBBX30-1，2，3單克隆于5 mL LB培養基中，37 ℃震蕩培養至OD600=0.6～0.8，然后加6 μL IPTG，23 ℃震蕩培養過夜，離心收集菌體備用．SDS-PAGE檢測:配置凝膠質量分數為12.6%的分離膠，在燒杯中依次加入下列試劑：30%丙烯酰胺1.5 mL，pH 8.8，1 mol/L Tris-HCl 1.2 5 mL，蒸餾水7.05 mL，10%SDS 100 μL，10%過硫酸100 μL，TEMED 10 μL.將所收集菌體用PBS磷酸緩沖液重懸，超聲波破碎10 min后離心棄上清，加10 μL loading buffer充分混勻后沸水浴10 min，冷卻后上樣.

分別挑BL21/pET-30a，BL21/30a-OsBBX30單克隆于5 mL LB培養基中，37 ℃震蕩培養至OD600=0.6～0.8；加6 μL IPTG，23 ℃震蕩培養過夜；將培養物置于50 ℃下分別震蕩培養0 h，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h和3 h；將菌液稀釋100倍后涂布于LB平板，37 ℃倒置培養過夜；拍照、計數.

1.2.5 OsBBX30基因表達水平的定量PCR(qRT-PCR) 驗證

水稻幼穗分化至6～7期的整片劍葉進行了42 ℃高溫熱處理0 h，3 h ,6 h，12 h后利用Q-PCR對OsBBX30基因表達水平進行了驗證.首先，利用Primer Premier 5.0設計序列特異的Q-PCR引物(表1)，actin為內參基因.采用Trizol 法抽提水稻葉片總RNA，利用反轉錄試劑盒轉錄成cDNA，再利用UltraSYBR Mixture(with ROX)試劑盒配制20 μL體系: 13.2 μL ddH2O，5 μL mix，前后引物各0.4 μL，1 μLcDNA.在ABI7300上進行qRT-PCR反應，反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 32 s，40個循環.通過溶解曲線來確定Q-PCR反應的特異性.再利用相對定量(2-△△Ct)[8]分析目標基因表達水平的變化[9].

表1 OsBBX30 基因的qRT-PCR的引物

2 結果與分析

2.1 芯片數據分析

2.1.1 啟動子作用元件分析

通過RMAP軟件分析表明水稻基因OsBBX30(LOC_Os12g10660)位于12號染色體中，長度為2537 bp，通過將其啟動子序列放入PLANTCARE里面進行啟動子元件分析.發現除了含有多個 TATA-Box 和 CAAT-Box 等基本轉錄元件外，還有多個與逆境相關的元件.其中高溫響應元件有HSE，circadian，G-box，Skn-1_motif，ACE，干旱低溫響應元件有 MBS，ARE元件.此外，還含有大量與光響應的元件，如 GA-motif，chs-CMA1a，ERE,MRE 等.

2.1.2 OsBBX30蛋白同源性分析

通過NCBI搜索到OsBBX30的蛋白序列，將其蛋白序列放入STRING網站搜索結果發現LOC_Os12g10660在粳稻中發現的同源性較高的蛋白都為DBB亞家族中的蛋白.在其他物種如水稻秈稻，二穗短柄草，高粱，葡萄，擬南芥，苔蘚，毛果楊這7種(見表2)也發現同源性較高的蛋白.同時也發現了10種與OsBBX30蛋白功能協作的蛋白質，其中相互作用最強的3種蛋白質都來自粳稻品種(表3).

表2 多種物種中同源蛋白

表3 預測的功能協作蛋白

2.1.3 水稻芯片分析

因為OsBBX30基因中含有HSE元件，因此將其在ROAD網站中進行了分析.在OsBBX30基因響應熱脅迫中，結果表明(圖1(a))OsBBX30基因的2個探針在根部的表達量都較高，經過 42 ℃的熱脅迫處理，該基因的表達量升高很多，表明該基因對熱脅迫逆境有正響應作用.圖1(b)結果則表明OsBBX30基因的2個探針在秈稻干旱脅迫敏感型和秈稻干旱脅迫耐受型中其表達量都很低.經過干旱脅迫后，其表達量上調明顯，表明該基因在同種材料不同類型中對干旱脅迫起到相同的正調控作用.

(a)芯片分析OsBBX30基因響應熱脅迫

(b)芯片分析OsBBX30基因響應干旱脅迫

2.2 原核表達載體構建

為進一步研究水稻OsBBX30基因的功能，本實驗構建了一個原核表達載體PET-30a，用于體外表達OsBBX鋅指蛋白.以水稻基因組cDNA為模板，PCR擴增得到目的片段(圖2(a)).將該目的片段進行純化回收鏈接到pGEM-T上，并轉化至大腸桿菌DH5α中，獲得帶有目的片段的重組載體.將獲得的重組載體的陽性菌落進行擴大培養，提取質粒.經過HindⅢ與EcoRⅠ酶切，膠回收，去磷酸化，連接，轉化4個步驟將目的片段連接到PET-30a上，獲得重組載體(圖2(b)).

(a) M: marker；1: OsBBX30 PCR產物

(b) M:marker；1: 30a-OsBBX30經Hind Ⅲ與EcoR

2.3 大腸桿菌耐熱性分析

將構建好的30a-OsBBX30載體轉化大腸桿菌BL21，確定誘導條件后批量搖菌，超聲波破碎后離心收集沉淀，加樣品稀釋液后點樣.在電壓150 V下電泳1 h，電泳圖見圖3，圖中Ⅰ為空載未經IPTG誘導；Ⅱ為空載經IPTG誘導；Ⅲ為30a-OsBBX30未經IPTG誘導：Ⅳ為30a-OsBBX30經IPTG誘導．由圖3中可發現,與負對照相比在14～20 KD處出現一條額外條帶，即OsBBX30與His Tag的融合蛋白.

生物信息學分析表明OsBBX30含有HSE順式作用元件，受高溫誘導.本實驗對轉入了OsBBX30的大腸桿菌菌株進行了耐熱性分析，熱處理溫度為50 ℃，并以含pET-30a空載體的大腸桿菌做負對照，通過MTT法測定大腸桿菌活數[10]，結果發現含OsBBX30的轉基因大腸桿菌的存活率較含pET-30a空載體的大腸桿菌有明顯提高.說明OsBBX30融合蛋白可能與細菌耐熱相關蛋白相互作用，使其對熱脅迫的耐受有所提高(圖4).

融合蛋白SDS-PAGE檢測

50 ℃熱處理時間/h

2.4 水稻熱脅迫分析

為了證實OsBBX30基因在水稻中受熱脅迫誘導，筆者選用日本晴，9311，N22，3種水稻品種在0 h，3 h，6 h，12 h進行42 ℃熱處理，以0 h處理作為對照組，采用熒光定量PCR檢測OsBBX30基因的表達水平，結果表明(圖5)，在不同的水稻品種中，OsBBX30基因表達各異.日本晴品種中OsBBX30基因表達量較低，在12 h處理后，OsBBX30基因的相對表達量又有所增加.9311品種中OsBBX30基因表達量也低，并且其相對表達量降低，而N22品種中，OsBBX30基因表達呈明顯增加，且隨熱處理時間延長，其相對表達量呈現明顯增加趨勢.日本晴為粳稻常規水稻，9311為秈稻常規水稻，N22為秈稻耐高溫品種.在上述結果我們證明了，OsBBX30基因在N22中經過熱處理后，影響其表達量，推測OsBBX30為耐熱基因.

圖5 OsBBX30在不同水稻的相對表達量

3 結 論

通過PLANTCARE分析發現,OsBBX30的啟動子區域含有多個的逆境響應順式作用元件，如HSE,G-box和ABREs等，結合芯片分析結果發現OsBBX30的表達受高溫誘導.通過實時定量PCR驗證發現該基因在耐熱水稻品種N22中的表達明顯受熱脅迫誘導，由此表明含有逆境響應順式作用元件的啟動子在植物逆境脅迫響應過程中可能起到至關重要的作用.研究發現，水稻N22品種是最耐熱的秈型常規稻，其在38 ℃高溫下的生產率仍達到64%～86%[11].9311作為秈型常規稻，其品質優、產量高[12-13].日本晴屬粳亞種，對溫度和日照長度無特殊響應[14].此外，本研究發現OsBBX30蛋白提高了大腸桿菌對高溫的耐受性，進一步證明OsBBX30與生物耐受熱脅迫存在聯系.OsBBX30表達受熱脅迫誘導的特征為深入了解水稻的耐熱分子信號傳導途徑提供了新的思路，為水稻抗逆分子育種提供了新的參考，為全面了解水稻抗逆的分子機制奠定了基礎.

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Clone and Expression Analysis of Heat InducedOsBBX30 in Rice

RAO Li-qun，LIU Lan-lan, WANG Qi-ming?,SHUAI Jin, PENG Peng,LI Meng-yun, TANG Shi-wei

(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural Univ, Changsha，Hunan 410128，China)

Bioinformatics analysis indicates that the promoter ofOsBBX30 contains function element HSE, which is related with adversity. In this study, it is found thatOsBBX30 gene expression is induced by heat stress, which enhances the E. coli heat resistant ability through bioinformatics,Gene clone prokaryotic expression and real-time quantitative PCR analysis. The results are helpful in understanding the family genes and rice heat resistant genes.

clone;OsBBX； heat stress; Q-PCR

1674-2974(2015)06-0101-06

2014-12-21

國家自然科學基金資助項目(31301081)，National Natural Science Foundation of China(31301081) ；科技部國家科技支撐計劃項目(2014BAD01B04)；教育部博士點基金資助項目(20134320120009)；湖南省自然科學基金資助項目(14JJ3094)；湖南省教育廳科學研究優秀青年基金資助項目(12B062)；湖南省教育廳創新平臺開放基金資助項目(13K063)

饒力群(1962-)，男，湖南株洲人，湖南農業大學教授

?通訊聯系人，E-mail:wqmqmx21@126.com

S511

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