MMP-2 基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死初發(fā)及復(fù)發(fā)相關(guān)性研究

李 鳳，陳 明，喻 明，李琳琳，聶本剛

腦梗死是指腦部血液供應(yīng)障礙，腦組織缺血缺氧導(dǎo)致壞死，從而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損，占全部卒中的60%～80%［1］，動(dòng)脈粥樣硬化是其最常見的病因［2］。首發(fā)的腦梗死患者，能及時(shí)治療，多數(shù)能夠進(jìn)入到恢復(fù)期和后遺癥期繼續(xù)治療，而腦梗死一旦復(fù)發(fā)，其癥狀重于初發(fā)，愈發(fā)難治并危及生命。在我國，腦梗死5 y 內(nèi)的平均復(fù)發(fā)率高達(dá)40%以上。如何防止腦梗死復(fù)發(fā)，是當(dāng)今國內(nèi)外研究的一個(gè)重要課題。腦卒中與遺傳多態(tài)性的研究是近年生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。家族聚集性研究、雙生子研究、家系的復(fù)合分離分析和遺傳模式分析等多種研究方法結(jié)果表明腦卒中符合多基因遺傳方式，盡管國內(nèi)、外已廣泛開展該病的分子遺傳學(xué)研究，但得到公認(rèn)的陽性結(jié)果不多，各研究結(jié)論亦難以互相重復(fù)或驗(yàn)證［3］。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種可降解細(xì)胞外基質(zhì)的鈣鋅離子依賴性蛋白酶，一直被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的一種重要炎癥介質(zhì)，可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。MMP-2 是MMPS 家族的主要成員，與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。而MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，基因失活對(duì)輕微損傷引起的血栓形成有保護(hù)作用，并中度延長(zhǎng)出血時(shí)間［5］。目前國內(nèi)外尚未見MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死初發(fā)及復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死初發(fā)及復(fù)發(fā)的相關(guān)性，為腦梗死的預(yù)防及治療提供新的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 篩選2012 年4 月～2014 年4月在本院神經(jīng)內(nèi)科連續(xù)住院的腦梗死患者。入選方法:(1)初發(fā)腦梗死患者:在我院住院，確診為首次發(fā)生腦梗死患者;(2)復(fù)發(fā)腦梗死患者:在我院住院患者，既往有腦梗死病史;(3)正常健康組:在我院體檢科體檢的正常人群。入選標(biāo)準(zhǔn):全部入選病例符合1995 年全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，年齡≥18 歲，腦梗死發(fā)病3 d 內(nèi)入院，并經(jīng)臨床、頭部CT 和/或MRI 掃描確診，所有病例組行頸部血管彩超檢查，部分患者行頭部MRA 檢查，根據(jù)TOAST 分型標(biāo)準(zhǔn)［6］選出大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者。其中復(fù)發(fā)性腦梗死同時(shí)需滿足:(1)出現(xiàn)新的神經(jīng)功能缺損癥狀;(2)初發(fā)癥狀加重，距第一次梗死時(shí)間大于一個(gè)月，排除進(jìn)展性卒中;(3)影像證實(shí)有新的缺血病灶。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)不合作者，患者或家屬不同意參與該研究或拒絕留取標(biāo)本;(2)有動(dòng)脈炎和其他血管炎、腦動(dòng)脈畸形和心源性腦栓塞;(3)有嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)感染或其他嚴(yán)重感染疾病;(4)有嚴(yán)重的肝臟疾病和(或)肝功能損害者;(5)有嚴(yán)重的腎臟疾病和(或)腎功能損害者，經(jīng)腎功能檢查提示Cr ＞220 μmol/L;(6)有嚴(yán)重貧血者，經(jīng)血常規(guī)檢測(cè)提示Hb ＜80 g/L，或者凝血功能障礙或其他嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾病;(7)近期有外傷史、手術(shù)史、妊娠史、傳染性疾病以及寄生蟲疾病史;(8)近6 個(gè)月來有服用降脂藥治療和(或)雌激素及避孕藥史;(9)有嚴(yán)重的內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病和(或)惡性腫瘤。所有研究對(duì)象間無血緣關(guān)系，在納入研究前每位入組者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 所有患者于入院次日清晨空腹抽血檢測(cè)血糖、血脂等水平，酶聯(lián)免疫吸附法(美國R＆D 公司試劑盒)檢測(cè)血清MMP-2 水平。MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多態(tài)性檢測(cè)采用PCR 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)。(1)DNA 提取:清晨空腹抽取的肘靜脈血置于抗凝管中，-80 ℃冰箱凍存。采用血液基因組提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)抽提基因組DNA。(2)引物的設(shè)計(jì)及合成:運(yùn)用Primer5.0 軟件(加拿大Premier公司)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。MMP-2 基因735C/T 上游引物序列:5’-ATCCTGTGACGGAGAATG-3’，下 游 引 物 序 列:5’-TAAAATGAGGCTGAGACC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為164 bp。MMP-2 基因1306C/T 上游引物序列:5’-CTTACCCCGAGTCCTATCTGCC-3’，下游引物序列:5’-TCTTGGGAACGCCTGACTTCAG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為193 bp。(3)PCR 反應(yīng)條件95 ℃5 min，(94 ℃45 s，56℃ 30 s，72 ℃ 35 s) × 30 cycles，72 ℃10 min。PCR 反應(yīng)體系為10 ×buffer 2 μl，dNTP(各10 mmol/L)1 μl，上下游引物各1 μl，DNA 模板0.1 μg，DNA 聚合酶2 U，加ddH2O 至總體積20 μl。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀檢測(cè)PCR 產(chǎn)物特異性，PCR 純化試劑盒(德國Qiagen 公司)純化PCR 產(chǎn)物。(4)酶切反應(yīng):反應(yīng)體系包括PCR 純化產(chǎn)物1 μg，10 ×buffer 1 μl，XspⅠ內(nèi)切酶1.5 U(1306C/T)或HinfⅠ內(nèi)切酶1.5 U(735C/T)(New England Biolabs 公司)，加ddH2O 至10 μl 體積，置于37 ℃酶切16 h，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀判定結(jié)果。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，釆用Hardy-Weinberg 平衡法檢測(cè)樣本的群體代表性。所測(cè)數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()描述，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，各組之間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較法(LSD 法)，兩樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較(t 檢驗(yàn))，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%的置信區(qū)間(confidence index，CI)表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。綜合評(píng)價(jià)各因素與初發(fā)腦梗死、復(fù)發(fā)腦梗死的相關(guān)性采用多因素Logistic 回歸分析。P ＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 最終入組初發(fā)腦梗死350 例，復(fù)發(fā)腦梗死340 例，正常健康組(對(duì)照組)360 例。3 組一般臨床資料比較如下(見表1)。

2.2 3 組血清MMP-2 水平的比較 初發(fā)腦梗死組及復(fù)發(fā)腦梗死組血清MMP-2 水平顯著高于對(duì)照組，且復(fù)發(fā)腦梗死組高于初發(fā)腦梗死組［(3.32 ±0.94)vs (2.93 ±0.53)mg/L，P ＜0.01］。以表1中所有的變量作為自變量(有=1，無=0)，是否發(fā)生腦梗死為因變量(發(fā)生腦梗死=1，對(duì)照組=0)進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示血漿MMP-2 水平增高不是發(fā)生腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR 0.820，95%CI 0.620～1.058，P ＞0.01;OR:0.719，95%CI:0.528～1.016，P ＞0.05)。

2.3 3 組MMP-2 基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組、初發(fā)腦梗死組及復(fù)發(fā)腦梗死組人群MMP-2 基因1306C/T(χ2=0.523，P ＞0.05)和735C/T(χ2=0.891，P ＞0.05)多態(tài)性分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。(1)3 組MMP-2 1306C/T基因型(χ2=1.075，P ＞0.01)和等位基因(χ2=1.124，P ＞0.01)的頻率分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XspⅠ內(nèi)切酶酶切為CC 基因型可見188 bp 的基因片段，CT 型可見188、162 bp2個(gè)基因片段，TT 基因型可見162 bp 的基因片段。(2)735C/T 基因:PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HinfⅠ內(nèi)切酶酶切為3 種基因型:純合子C/C(僅有164 bp 一條帶);雜合子C/T(可見164 bp、143 bp、68 bp3 條帶)，純合突變子T/T(可見143 bp、68 bp 兩條帶)。復(fù)發(fā)腦梗死組C 等位基因頻率明顯升高，與初發(fā)腦梗死組相比(92.5% vs 87.9%，χ2=4.398，P ＞0.01)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與對(duì)照組相比(92.5%vs 78.5%，χ2=8.121;P ＜0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;初發(fā)腦梗死組與對(duì)照組相比(87.9% vs 78.5%，χ2=4.121;P ＞0.01)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。以MMP-2 735C/T 基因型作為自變量(CC=1，CT=0)，是否發(fā)生腦梗死為因變量(發(fā)生腦梗死=1，正常對(duì)照組=0)進(jìn)行Logistic 回歸分析，MMP-2 735C/T 多態(tài)性是腦梗死復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR:1.765，95%CI:1.177～2.676，P=0.006)。

表1 研究對(duì)象的一般資料比較

表2 3 組人群MMP-2 1306C/T 基因型及等位基因頻率分布(例，%)

表3 3 組人群MMP-2 735C/T 基因型及等位基因頻率分布(例，%)

3 討論

腦梗死是一個(gè)多基因遺傳疾病，到目前為止關(guān)于腦梗死確切的發(fā)病機(jī)制及病理生理過程仍然不清楚。隨著生活水平的提高及人口老齡化的加劇，腦梗死發(fā)生及復(fù)發(fā)越來越多。目前如何防止腦梗死發(fā)生及復(fù)發(fā)存在很大的問題。已有的研究［7，8］發(fā)現(xiàn)MMP-2 與血管再生、炎性反應(yīng)存在密切相關(guān)性，在腦梗死的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。MMP-2 可特異性的降解膠原、彈性蛋白和纖維蛋白，削弱動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，裂解基底膜及血腦脊液屏障，參與血管內(nèi)膜的聚集、浸潤和活化，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂，參與梗死后炎癥反應(yīng)、繼發(fā)性腦損傷及損傷的神經(jīng)修復(fù)過程［9］。Brouns 等發(fā)現(xiàn)腦梗死患者在急性期MMP-2 明顯增加，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，造成血腦屏障開放和血管通透性增加，導(dǎo)致血管源性腦水腫［10］。Halder 等則發(fā)現(xiàn)MMP-2 水平與腦梗死后神經(jīng)功能缺損程度之間呈現(xiàn)出一定相關(guān)性［11］。Stemlich等發(fā)現(xiàn)MMP-2 在腦卒中發(fā)生的4 個(gè)月甚至數(shù)年后仍然表達(dá)增高［12］。本研究顯示兩組動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死組患者的血清MMP-2 水平均顯著高于正常組，且復(fù)發(fā)腦梗死組高于初發(fā)腦梗死組，提示MMP-2 參與了腦梗死的發(fā)生，與先前的研究相一致。

人類MMP-2 基因位于染色體16q13～21，分子量為72 kD，包含13 個(gè)外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子。已發(fā)現(xiàn)在MMP-2 基因中存在多個(gè)序列變異，其中關(guān)于1306C/T 和735C/T 多態(tài)位點(diǎn)的研究報(bào)道較少。MMP-2 1306C/T 和735C/T 多態(tài)變異性是指MMP-2基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游的1306 處和735 處存在的C被T 取代。啟動(dòng)子直接參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這些多態(tài)性的發(fā)生可能會(huì)對(duì)MMP-2 的轉(zhuǎn)錄能力產(chǎn)生直接的影響。MMP-2 1306C/T 存在的連鎖不平衡現(xiàn)象導(dǎo)致了1306T 單體型的出現(xiàn)，與1306T/735T 單體型相比，攜帶1306C/735C 單體型的組織中MMP-2 mRNA 水平明顯增高。以往的研究對(duì)735C/T 進(jìn)行功能分析后發(fā)現(xiàn)735C→T 改變了Sp1(CCACC 盒)的結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄活性降低。認(rèn)為MMP-2 基因的多態(tài)性影響血清MMP-2 的水平，進(jìn)而影響了疾病的發(fā)生發(fā)展。Manso［13］等發(fā)現(xiàn)MMP-2 基因多態(tài)性與腦梗死3 個(gè)月后的轉(zhuǎn)歸相關(guān)。另外的研究則發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段，即血管重建和血管增厚發(fā)生時(shí)，MMP-2 1306C/T 和735C/T 位點(diǎn)的多態(tài)性與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度無直接關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2 基因1306C/T 的基因型和等位基因的頻率分布在3 組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.01)。而MMP-2 基因735C/T 的CC 基因型和C等位基因頻率在腦梗死組明顯高于對(duì)照組，且復(fù)發(fā)腦梗死組高于初發(fā)腦梗死組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示MMP-2 735C/T 的C 等位基因可能是腦梗死復(fù)發(fā)的潛在危險(xiǎn)因素。推測(cè)其中可能的機(jī)制為MMP-2 735C/T 的C 等位基因頻率在復(fù)發(fā)腦梗死組明顯高于另外兩組，致使基因轉(zhuǎn)錄活性增加，引起梗死區(qū)MMP-2 表達(dá)上調(diào)，在局部聚集的MMP-2 一方面通過降解血管壁細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增值形成泡沫細(xì)胞引起血管壁的炎性反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成;另一方面還可破壞斑塊表面的纖維帽，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的破裂，繼發(fā)血栓形成和機(jī)化導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化損傷的快速進(jìn)展和斑塊擴(kuò)大，造成再次腦梗死。同時(shí)，腦血腦屏障破壞、血管通透性增高、局部升高的MMP-2 進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)，致使血清MMP-2 水平也升高。

綜上所述，本研究結(jié)果表明MMP-2 基因735C/T的C 等位基因是腦梗死遺傳易感基因之一，可能是腦梗死復(fù)發(fā)的潛在危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)存在樣本量偏小等不足之處，繼續(xù)收集臨床病例擴(kuò)大樣本量將有助于進(jìn)一步了解MMP-2 基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系，為腦梗死的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。

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