探索學習對腦梗死大鼠缺血側海馬區微血管密度及Flt-1 表達的影響

馬向陽，王永新，張麗萍，劉冬梅，楊 揚

腦血管病特別是腦卒中是當前社會最常見的疾病之一，死亡率和致殘率高。近年來，腦卒中的康復日益受到重視，康復治療和訓練在腦卒中后神經功能恢復中的重要性得到肯定，而腦的可塑性和功能重組是腦卒中后神經功能恢復主要機制，有研究證實腦的可塑性受學習訓練的影響［1］。為進一步研究探索學習對腦損傷修復的作用機制，本研究探討對局灶性腦缺血大鼠缺血側海馬區微血管密度、血管內皮生長因子受體Flt-1 表達的影響，為臨床應用探索學習于腦卒中康復提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD 大鼠80 只，3～4 月齡，體質量230～260 g，購自河南醫科大學實驗動物學部。

1.2 制作MCAO 模型及分組 參照賈子善等的方法［2］制作MCAO 模型。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100g 體質量)腹腔注射麻醉大鼠，左側側臥位固定，常規消毒后，在右眼與右耳之間切開皮膚，分離顳肌，暴露顳骨翼板，術中避免損傷面神經、面部主要動脈、靜脈、眼外肌及淚腺和顴弓。在手術顯微鏡下，用牙鉆經顳骨翼板鉆至硬腦膜，暴露大腦中動脈后，用小咬骨鉗向下咬去部分顱骨，用電凝器閉塞嗅束近端至大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈，依次縫合顳肌及皮膚。腹腔內注射0.2 萬單位青霉素以預防感染。共用大鼠114 只，有80 只符合入選條件(蘇醒后右眼出現Horner 征及左側肢體偏癱)并存活到規定時間。術后24 h 將大鼠隨機分為標準環境(SE)組，探索學習(LE)組各40 只。

1.3 造模后飼養環境 (1)SE 組飼養于標準籠(290 mm×178 mm×160 mm)，每籠5 只;(2)LE組:飼養于參考文獻［3］設計的迷宮籠，一籠20 只，迷宮籠由一個圓籠與一個方籠組成，直徑500 mm 圓籠同640 mm×480 mm×120 mm 方籠中間通過兩通道相連(圓籠中間由絲網分隔，一側為進食區，一側為飲水區;方籠:由絲網分隔形成通道寬80 mm ×80 mm的迷宮。迷宮由易到難，每周變換一次)。

1.4 標本的制備 兩組分別于術后1、3、7、14、28 d 各隨機取5 只大鼠，用10%水合氯醛腹腔內注射麻醉后固定于手術臺，剪開胸腔，暴露心臟，用9#針頭插入左心室，灌注生理鹽水，待右心耳膨起，剪開右心耳讓血液流出，至右心耳流出液為無色透明時，開始用4%多聚甲醛灌注固定，每只大鼠約需200 ml，總量在20～30 min 內灌完，立即在視交叉處切開后取出大腦，浸于4%多聚甲醛中再固定4 h。經常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做7 μm厚連續切片，每隔100 μm 連續取3 張，相鄰切片分為2 套，分別用于微血管密度和Flt-1 的免疫組化測定。

1.5 Flt-1 免疫組化實驗 采用免疫組織化學ASB 法檢測Flt-1，操作步驟嚴格按說明書進行。將腦組織切片，60 ℃烤箱內烘烤2 h 后，放于4 ℃冰箱內備用。石蠟切片經二甲苯脫蠟后依次經過100%、95%、80%乙醇脫水;3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶10 min，抗原熱修復后，滴加一抗，37 ℃孵育20 min;滴加DAB 顯色劑，顯微鏡下觀察至顯色較好時，終止顯色，依次經蘇木素復染，2%鹽酸乙醇分色，藍化;經80%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，最后封片，貼標簽備查。

1.6 微血管密度(Microvesseldensity，MVD)測定 MVD 計數參照文獻方法［4］，凡CD34 免疫組織化學染色成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為一個血管計數，每張切片在同一缺血側海馬區選擇4 個高倍(×400)視野進行微血管計數，計算每mm2面積內微血管的數量，即MVD，然后求其均值，每個時間點每組有15 張切片結果。

1.7 圖像分析及統計學處理 采用SPSS7.5 版軟件系統圖像采集卡、顯微鏡全自動圖像分析系統進行圖像分析，每張切片于10×40 放大倍數下，采用雙盲法從缺血側海馬區隨機選5 個視野，統計每個視野Flt-1 陽性細胞數。采用SPSS 12.0 統計軟件包進行數據處理，計量資料用均數±標準差()表示，兩樣本均數比較采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微血管密度比較 CD34 免疫組織化學染色結果顯示，微血管形態不規則，管腔由染成棕黃色的內皮細胞圍成。SE、LE 組大鼠缺血側海馬區14 d和28 d 時可見較多散在的單個內皮細胞，LE 組14 d和28 d 時微血管密度明顯多于相應時間的SE 組，差異有顯著性意義(P ＜0.05)(見表1、圖1)。

2.2 Flt-1 免疫組化染色結果 SE 組、LE 組大鼠MCAO 術后1 d 時，缺血側海馬區Flt-1 表達最高，第3 天明顯下降，7 d 時仍有表達，14 d 時表達基本恢復正常(見圖2)。1 d、3 d、7 d 時LE 組Flt-1 在缺血側海馬區的表達均明顯高于SE 組，差異有統計學意義(見表2)。

表1 兩組大鼠缺血側海馬區微血管密度比較()血管數/mm2

表1 兩組大鼠缺血側海馬區微血管密度比較()血管數/mm2

與SE 組比較* P ＜0.05

表2 兩組大鼠缺血側海馬區Flt-1 陽性細胞記數比較(個，)

表2 兩組大鼠缺血側海馬區Flt-1 陽性細胞記數比較(個，)

與SE 組比較* P ＜0.05

3 討論

腦血管閉塞以后，神經細胞轉歸受多種因素的影響，其中血供的恢復是重要因素。血管新生是決定缺血性神經元存活的關鍵因素，與缺血性腦卒中患者的預后關系密切［5］，Marti 等［6］的研究表明，在大腦中動脈閉塞后，血管內皮生長因子與受體(VEGF/VEGFR)系統可以誘導大腦缺血后新血管的形成，新形成的側支血管可改善缺血區周圍的組織灌流，其增生的范圍和程度直接關系到梗死灶周圍血流的改善，影響神經元生理功能的恢復［7］;此外，血管生成還可以通過改善神經干細胞成體生發區的血管微環境促進神經干細胞增殖［8］，從而進一步促進腦梗死神經功能的恢復。目前較肯定的VEGF 家族受體共有Flt-1(Fms-like tyrosine-1，VEGF-1)、Flk-1(VEGF-2)、Flt-4(VEGF-3)、np-1(神經纖維網蛋白-1)、np-2(神經纖維網蛋白-2)等［9］。VEGFR 的生物學效應主要為促進內皮細胞有絲分裂，誘導血管內皮細胞增殖、分化和遷徙，這是VEGF 和VEGFR 結合后最明顯的生物學效應;另外還有增加血管的通透性及神經保護作用［10］，在促進新生血管生成的過程中，不同的受體具有各自特異的生物學特性。目前，在腦梗死中研究最多的是Flt-1［10］，對VEGF 非常敏感，參與完成血管的新生。本實驗選擇Flt-1 為VEGF 受體的代表進行研究。探索學習環境由社會交往、探索學習和體力活動等成分構成［11］，對成年腦損傷動物的研究已證實，探索學習環境能減輕腦損傷，改善腦功能，促進腦損傷修復［12］。

圖1 缺血側海馬區微血管密度表達，染色法:×400

圖2 海馬區Flt-1 表達，染色法:×400

本實驗結果顯示，MCAO 術后1 d 缺血側海馬區Flt-1 表達最高，第3 天明顯下降，1 d、3 d、7 d 時LE組Flt-1 在缺血側海馬區的表達均明顯高于SE 組。兩組Flt-1 在MCAO 后均有表達，LE 組表達明顯高于SE 組，提示探索學習可以促進Flt-1 的表達。說明腦梗死缺血缺氧可以誘使海馬區Flt-1 表達，探索學習環境干預可促進兩者的表達。對MCAO 后大鼠MVD 的分析結果顯示，術后14 d 和28 d 時兩組缺血側海馬區均有微血管表達，而LE 組又明顯多于相應時間的SE 組，說明探索學習環境對MCAO 后缺血側海馬區微血管增生有促進作用。該實驗結果還顯示，MCAO 后微血管明顯增生的時間在術后14 d 和28 d，明顯晚于Flt-1 表達的時間。以往結果顯示［13］，LE 干預后大鼠學習記憶能力得到顯著改善，幾乎恢復到正常水平。說明探索學習可使動物不斷地主動學習、接受新的信息而改變自身行為、適應新的環境、不斷用新的記憶取代舊的記憶，可能是先通過促進腦缺血缺氧后海馬區血管內皮生長因子受體的表達，繼而依靠與血管內皮生長因子的相互結合對神經系統起著直接的保護作用，從而延長細胞的存活時間，直到新血管形成，從而促進海馬區微血管新生，改善側支循環，進而改善腦缺血后海馬區血流量，改善學習記憶等神經功能。這可能是探索學習環境促進腦缺血后記憶功能恢復的一個重要機制。

［1］Johansson BB.Regeneration and plasticity in the brain and spinal cord［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(8):1417 -1430.

［2］賈子善，李 闊，槐亞萍，等.不同環境干預對局灶性腦梗死大鼠行為學恢復的影響［J］.中國康復醫學雜志，2007，22(7):578-580.

［3］高俊淑，李 闊，李 娜，等.探索學習對局灶性腦梗死大鼠梗死灶周圍皮質BDNF 的影響［J］.中國康復醫學雜志，2007，22(7):583-585.

［4］金玉玲，吳盛華，朱曉峰.電刺激小腦頂核聯合神經干細胞共移植體治療大鼠局灶性腦缺血［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(20):3956 -3959.

［5］Ding YH J，Zhou Y.Cerebral angiogenesis and expression of angiogenic factors in anging rats after exercise［J］.Curr Neurovasc Res，2006，3(1):15 -23.

［6］Marti HJ，Bernaudin M，Bellail A，et al.Hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expression precedes neovascu-larization after cerebral ischemia［J］.Am J Pathol，2000，156:965 -976.

［7］Zhang ZG，Zhang L，Jiang Q，et al.VEGF enhances angiogen-esis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain［J］.J Clin lnvest，2000，106:829 -838.

［8］Palmer TD，Wliihoite AR，Gage FH.Vascular niche for adult hippocam-pal neurogenesis［J］.J Comp Neurol，2000，425:479 -494.

［9］Nsihida N，Yano H，Komai K，et al.Vascular endothelial growth factor-C and vascular endothelial growth factor receptor 2 are relate closely to the prognosis of patients with ovarian carcinoma［J］.Carcinoma，2004，101:1364 -1374.

［10］王麗梅，劉曉燕，王樹鶴，等.血管內皮生長因子及其受體在卵巢癌中的表達及與微血管密度的關系［J］.中華婦幼臨床醫學雜志，2012，8(2):179 -182.

［11］槐雅萍，賈新風，閆桂芳，等.探索學習對局灶性腦梗死大鼠梗死灶周圍皮Ng 及gbFGF 表達的影響［J］.中國康復醫學雜志，2009，24(3):216 -218.

［12］馬向陽，賈子善，槐雅萍，等.探索學習對局灶性腦梗死大鼠梗死灶周圍Flk-1、VEGF 表達的影響［J］.中國康復醫學雜志，2009，24(3):219 -221.

［13］馬向陽，賈子善，槐雅萍，等.探索學習對局灶性腦梗死大鼠學習記憶和新生血管的影響［J］.中國康復醫學雜志，2008，23(12):1086 -1088.