地佐辛后處理對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷影響

孫岳楓，李 波，呂國義

腦組織對缺血缺氧極其敏感，缺血性腦血管病是現代社會常見病，抑制腦缺血/再灌注損傷是缺血性卒中治療的重要環節。線粒體ATP 敏感性鉀通道是多種處理措施或藥物的作用靶點，通道開放后可減輕神經元缺血性損傷［1～3］。地佐辛是一種新型的阿片受體激動-拮抗劑，眾多研究表明阿片類受體激動劑可抑制腦缺血/再灌注損傷所致的神經細胞凋亡，具有減輕缺血對器官的損傷作用［4，5］。目前，地佐辛應用于腦缺血/再灌注損傷研究罕有報道。本研究旨探討地佐辛后給藥對于大鼠腦局灶性缺血/再灌注損傷的作用及其可能機制，進而為地佐辛在臨床的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組 72 只健康雄性SD 大鼠(軍事醫學科學院生物研究所)，體重250～300 g，隨機分為4 組(n=18):假手術組(S 組)、缺血/再灌注損傷組(IR 組)、地佐辛后給藥組(D 組)和5-羥基葵酸鈉(線粒體ATP 敏感性鉀通道抑制劑)組(5-HD組)。S 組右側頸內動脈置入線栓10 mm(不造成栓塞)，1 h 后拔出線栓，經股靜脈注射生理鹽水0.6 ml。IR 組線栓法缺血1 h，經股靜脈注射生理鹽水0.6 ml，再灌注24 h;D 組線栓法缺血1 h，再灌注即刻經股靜脈注射地佐辛注射液0.6 ml(含地佐辛3 mg)，再灌注24 h;5-HD 組于缺血前30 min 腹腔注射5-羥基葵酸鈉10 mg/kg，線栓法缺血1h，再灌注即刻經股靜脈注射地佐辛注射液0.6 ml(含地佐辛3 mg)，再灌注24 h。

1.2 主要藥品與試劑 地佐辛(揚子江藥業，中國)批號:13 121141;TUNEL 試劑盒(Roche 公司，瑞士);TTC 試劑(Sigma 公司，美國);SOD、皮質醇測定試劑盒(南京建成生物研究所，中國);caspase-3試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國)。

1.3 動物模型制備與神經行為學評分 術前參照文獻［6］方法頸內動脈尼龍線線栓法建立局灶性腦缺血/再灌注模型。術前大鼠禁食12 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg 麻醉下，取頸部正中切口，暴露右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，并結扎頸總動脈、頸外動脈，于頸總動脈分叉處剪一小口，將圓頭尼龍魚線(直徑0.26 mm)置入頸內動脈18～20 mm，至有阻力不能再進為止，術中保持自主呼吸。再灌注24 h 時參照文獻［6］采用的神經功能缺失評分，評分標準:無明顯神經損傷癥狀為0 分;不能完全伸展左側前爪為1 分;向左側劃圈為2 分;行走時向左側傾倒為3 分;不能自發行走伴神志喪失為4 分。模型制備成功的標準:神經功能缺失評分≥1分，并出現右側Homer 綜合征。再灌注2～3 h 未出現神經損傷癥狀(Longa 神經功能缺失評分為0 分)或已死亡的大鼠從實驗中剔除并隨即補充。

1.4 血清酶學活性及腦組織caspase-3(17 kDa)表達檢測 再灌注24 h 末，各組隨機取6 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg，心腔內取2 ml靜脈血，黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD 活性，ELISA 法定量測定血漿皮質醇水平。斷頭取腦，參照caspase-3 蛋白提取試劑盒說明提取蛋白，腦組織勻漿，加入細胞裂解液4 ℃靜置30 min，12000 r/min離心10 min，取上清液，進行蛋白定量。總蛋白經SDS-PAGE 分離后，轉移到PVDF 膜上。用TBST 洗3 次，10 min/次然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，隨后分別于一抗兔抗鼠caspase-3 抗體(稀釋度1 ∶1000)，4 ℃過夜，用TBST 洗3 次，10 min/次后，轉入二抗辣根酶標記兔抗山羊IgG(稀釋度1∶ 10000)中，用TBST 洗3 次，10 min/次。將PVDF 膜用發光試劑ECL 顯色，β-actin 作為內參，Tanon-4500 凝膠圖像處理系統掃描圖片，GIS 1D 軟件分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值(IA 值)反應目的蛋白表達水平。

1.5 細胞凋亡檢測 再灌注24 h 末，各組隨機取6 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg，麻醉后剪開胸腔，暴露心臟，灌注針自心尖插至主動脈起始端，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水200 ml，隨后灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液300 ml。斷頭取腦，于4%甲醛溶液固定，次日冠狀切取視交叉后4 mm組織，常規脫水、透明、浸蠟及包埋。石蠟切片機由前向后冠狀切片，片厚約4～6 μm。TUNEL 法計數凋亡神經細胞，具體操作步驟按TUNEL 試劑盒說明書進行。凋亡陽性細胞核呈棕黃色或棕褐色，于高倍鏡下(×400)在皮質缺血區隨機采集5 個不重疊視野，計數陽性凋亡細胞，取平均值計數凋亡神經元和神經元總數，計算凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.6 腦TTC 染色及腦梗死體積的測定 再灌注24 h 末，評分完成后，各組取6 支大鼠腹腔深麻醉，斷頭處死，取出缺血側頂葉腦組織。去掉小腦及低位腦干，視交叉前后制備，按2 mm 間隔冠狀切成6 片，置于TTC 溶液中，在37 ℃水浴中避光孵育30 min，待顯色完全后置于4%的多聚甲醛中固定24 h。用IBAS2.7 全自動圖像分析系統(Kont 公司，美國)進行圖像分析，白色為梗死區，求出梗死區面積，計算梗死體積(同側腦梗死面積×切片厚度÷腦總體積×100%)。

1.7 統計學處理 采用統計軟件SPSS16.0 處理數據，所有結果用均數±標準差()表示;組間比較采用單因素方差分析，組間兩樣本均數的比較采用q 檢驗(SNK 法)，等級資料比較采用Kruskalwallis H 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評分 再灌注24 h 末，與S 組比較，IR 組、D 組和5-HD 組各組Longa 神經功能缺陷評分明顯升高(P ＜0.05);與IR 組和5-HD 組比較，D 組神經功能缺陷評分明顯降低(P ＜0.05);IR組與5-HD 組比較無統計學意義(P ＞0.05)，結果(見表1)。

2.2 細胞凋亡率、血清皮質醇及SOD 變化再灌注24 h 末，與S 組比較，D 組、IR 組和5-HD 組細胞凋亡數明顯增多、血清中皮質醇水平明顯升高而SOD 活性下降、caspase-3 表達上調，差異有統計學意義(P ＜0.05);與IR 組和5-HD 組比較，D 組細胞凋亡數減少、血清中皮質醇水平明顯降低，而SOD 活性升高、caspase-3 表達下調，差異有統計學意義(P ＜0.05);IR 組與5-HD 組比較無統計學意義(P ＞0.05)，結果(見表2，見圖1、圖2)。

2.3 TTC 染色 再灌注24 h 末，S 組無明顯梗死區域;與IR 組和5-HD 組比較，D 組腦梗死體積明顯減小，差異有統計學意義(P ＜0.05);IR 組與5-HD 組比較無統計學意義(P ＞0.05)，結果(見表3，見圖3)。

表1 各組大鼠神經功能缺陷評分的比較(只，n=18)

表2 各組再灌注末caspase-3 表達、凋亡指數、酶學活性比較(，n=18)

表2 各組再灌注末caspase-3 表達、凋亡指數、酶學活性比較(，n=18)

與S 組比較* P ＜0.05;與D 組比較#P ＜0.05;與IR 組比較△P ＞0.05

表3 各組大鼠腦梗死體積的比較(，n=6)

表3 各組大鼠腦梗死體積的比較(，n=6)

與S 組比較* P ＜0.05;與D 組比較#P ＜0.05;與IR 組比較△P＞0.05

圖1 Western-blot 法檢測各組caspase-3 蛋白表達水平

3 討論

本研究采用阻斷右側大腦中動脈1 h，再灌注24 h的方法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型，結果表明，神經功能缺陷評分和腦梗死體積比明顯升高，表明局灶性腦缺血/再灌注損傷模型制備成功。參照文獻［7］和預實驗結果，本研究選擇地佐辛后處理。本研究取材時點設定為再灌注24 h，此時間點是神經細胞凋亡數與caspase-3 表達峰值的交叉點［8，9］。

SOD 活性可以反映機體對于氧自由基清除的能力。眾多研究表明，腦組織經歷缺血/再灌注損傷過程中產生大量的氧自由基，同時氧自由基清除系統功能降低或喪失。氧自由基可引發脂質過氧化，使膜受體、膜蛋白酶、離子通道和膜轉運系統等的脂質微環境變化，表現為細胞的呼吸鏈活性、細胞膜上離子泵受損，甚至導致腦組織發生不可逆性的損傷。有研究報道，阿片μ、κ 受體激動劑，可有效地減輕缺血再灌注引發的腦損傷［5］。本研究發現地佐辛后給藥組腦組織內SOD 的活性顯著增加，有效的減輕了氧化應激對于腦組織的損傷;而TTC 染色結果表明:地佐辛后給藥組腦梗死體積與IR 組相比較有明顯的降低，提示地佐辛作為阿片受體的激動-拮抗劑，其腦保護作用可能源于激動相關受體實現。皮質醇是腎上腺在應激反應里產生的一種類激素，一定程度上使機體能對外來應激作出有效反應。再灌注末，IR 組血漿皮質醇與D 組相比明顯升高，提示地佐辛可有效地減輕應激反應。caspase-3 處于凋亡有序級聯反應的下游，是細胞凋亡的關鍵執行者，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志［10］。本研究結果發現，與IR 組比較，D 組caspase-3 表達下調，且凋亡指數明顯降低。表明地佐辛后給藥可有效地減輕再灌注損傷造成的腦細胞凋亡。此外，實驗結果表明，給予線粒體敏感性鉀通道阻滯劑(5-HD)后，5-HD組細胞凋亡數明顯增多、血清中皮質醇水平明顯升高，而SOD 活性下降、caspase-3 表達上調，地佐辛后給藥腦保護的作用完全廢除，證明地佐辛腦保護作用是經由激活線粒體ATP 敏感性鉀通道開放實現的。

圖2 TUNEL 法染色細胞的形態(×200)

圖3 腦組織TTC 染色結果

綜上所述，地佐辛后給藥具有腦保護作用，可減輕局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠神經元凋亡，其機制可能與線粒體ATP 敏感性鉀通道激活及下調caspase-3 表達相關。

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