腦脈泰對(duì)ApoE 基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響

孟 星，牟靜靜，張雨晴，孟盼盼，李 琦

動(dòng)脈粥樣硬化以脂代謝異常和動(dòng)脈管壁的炎癥反應(yīng)為主要特征［1］。在動(dòng)脈粥樣硬化早期一般發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞的破損，中期及后期單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮黏附繼而遷移至血管內(nèi)皮下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，繼而發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊通常具有較大的脂質(zhì)壞死核心和一個(gè)薄纖維帽，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和基質(zhì)金屬蛋白酶的對(duì)纖維帽的降解促使不穩(wěn)定斑塊破裂，而由此引起的心腦血管事件目前已經(jīng)成為危險(xiǎn)人類健康的一大因素。ApoE 基因敲除小鼠在高脂飼料喂養(yǎng)下可自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化，且隨時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化斑塊損傷，這種病理發(fā)展情況與人動(dòng)脈粥樣硬化病情發(fā)展一致，常用于動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立。腦脈泰膠囊為桂林三金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的中藥新藥，由三七、銀杏葉、當(dāng)歸、紅花、丹參等活性中藥成分組成，具有益氣活血、熄風(fēng)豁痰、化瘀通絡(luò)的功效［2］。本實(shí)驗(yàn)以ApoE基因敲除小鼠作為動(dòng)脈粥樣硬化研究模型，探討腦脈泰對(duì)斑塊穩(wěn)定性的影響及MMP-9、MMP-2、CD68在不穩(wěn)定斑塊中的作用。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 腦脈泰膠囊內(nèi)容物由桂林三金藥業(yè)提供(批號(hào):130904)。阿托伐他汀，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)。西方膳食高脂飼料購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，含脂肪25%、膽固醇0.15%。HE染色液購(gòu)于碧云天生物公司。MMP-9 抗體、CD68抗體、MMP-2 抗體購(gòu)于武漢博士德有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 購(gòu)于Jackson 公司。DAB 顯色試劑盒(P0202)購(gòu)于碧云天生物公司。顯微鏡為日本OLYMPUS-BX51。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 ApoE 基因敲除小鼠48 只，雄性，6～8 周齡，體重18～22 g，購(gòu)于北京維通利華動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w 后，隨機(jī)分為4組，每組12 只，按照臨床推薦的常用量進(jìn)行換算灌胃給藥，分別為腦脈泰高劑量組(2.24 g/kg·d)、腦脈泰低劑量(0.56 g/kg·d)、阿托伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組(0.01 g/kg·d)、模型組給予等體積的生理鹽水，西方膳食高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。具有相同遺傳背景的C57/BL6J 小鼠12 只作為陰性對(duì)照組，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，給予等劑量的生理鹽水，普通飼料喂養(yǎng)。以上動(dòng)物均在SPF 級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.3 取材 喂養(yǎng)16 w 后，禁食12 h 以上處死小鼠。沿胸部正中處剪開(kāi)胸骨，迅速暴露胸腔，用鑷子輕輕夾起搏動(dòng)的心臟，剪掉右心耳，從心尖處進(jìn)針開(kāi)始灌注生理鹽水直至肝臟和肺部泛白，流出的液體透明清亮。取出動(dòng)脈根部到主動(dòng)脈弓的脈管，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋。從主動(dòng)脈根部開(kāi)始每隔50 μm 連續(xù)切片4 張，切片厚度5 μm，連續(xù)的4 張切片分別作形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化染色。

1.4 主動(dòng)脈HE 染色 常規(guī)石蠟切片脫蠟脫水:二甲苯(I)、二甲苯(II)各15 min，100%乙醇(I)、100%乙醇(II)各10 min，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min。蘇木精染色10 min，自來(lái)水沖去多余染色液2 min，1%鹽酸乙醇分化15 s。伊紅染色30 s，70%乙醇沖去多余的染色液。上行梯度脫水脫蠟后，中性樹(shù)膠封片，室溫條件下晾干，鏡下觀察。

1.5 主動(dòng)脈免疫組化染色 常規(guī)石蠟切片脫蠟脫水。室溫條件下，30%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性10 min。PBS 洗3 次，5 min/次。微波抗原修復(fù)，將組織切片放于10 mmol、pH6.0 的檸檬酸緩沖液中微波加熱至沸騰，微波爐內(nèi)放置7 min。反復(fù)3 次，最后一次取出緩沖液自然冷卻30 min。PBS 洗3 次，5 min/次。5%胎牛血清37 ℃濕盒孵育25 min，加入PBS 稀釋的一抗CD68(1 ∶ 100)、MMP-9(1∶ 100)、MMP-2(1∶ 100)，4 ℃過(guò)夜。PBS漂洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育50 min。PBS 漂洗后DAB 顯色，鏡下觀察顯色程度。蒸餾水充分沖洗以終止顯色，蘇木精10 s 復(fù)染。對(duì)照組以PBS 代替抗體，其余相同。上行梯度脫水脫蠟后中性樹(shù)膠封片，室溫晾干，鏡下觀察。每張切片選取3 個(gè)視野，用Image-Pro plus 6.0進(jìn)行光密度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。劑量組之間采用t 檢，P ＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥腦脈泰對(duì)小鼠主動(dòng)脈斑塊的影響經(jīng)過(guò)16 w 的高脂飼料喂養(yǎng)后，模型組在40 ×低倍鏡下內(nèi)膜出現(xiàn)明顯增厚，有大量斑塊形成。100 ×高倍鏡下可觀察到內(nèi)膜有大量泡沫細(xì)胞聚集，中膜平滑肌排列紊亂并向內(nèi)膜遷移，部分出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶。給予中藥腦脈泰后，內(nèi)膜增厚明顯改善，泡沫細(xì)胞減少，中膜平滑肌排列整齊，無(wú)膽固醇結(jié)晶。給予阿托伐他汀后，內(nèi)膜增厚程度明顯減小，與腦脈泰組無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖1、圖2)。

圖1 腦脈泰對(duì)ApoE 敲除小鼠主動(dòng)脈根部病理形態(tài)的影響(HE 染色40 ×)

圖2 腦脈泰對(duì)ApoE 敲除小鼠主動(dòng)脈根部病理形態(tài)的影響(HE 染色100 ×)

2.2 中藥腦脈泰對(duì)動(dòng)脈斑塊CD68 表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果表明，16 w 后模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)(黃褐色顆粒物)明顯較高。用Image Pro plus分析出，陰性組的吸光度值比值為(0.003 ±0.0003)，模型組的吸光度比值為(0.112 ±0.013)。與模型組相比，腦脈泰高低劑量組的吸光度比值均有下降，且有顯著性差異(P ＜0.05)，分別為(0.081 ±0.014)、(0.069 ±0.013)。阿托伐他汀組吸光度也有下降(0.073±0.007)，但與腦脈泰組相比無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖3)。

圖3 腦脈泰對(duì)ApoE 敲除小鼠主動(dòng)脈根部CD68 表達(dá)的影響

2.3 中藥腦脈泰對(duì)動(dòng)脈斑塊MMP-2 表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果表明，與陰性組相比(0.003 ±0.0009)，模型組的吸光度(0.131 ±0.013)顯著增高，而腦脈泰低高劑量組的吸光度比值與模型組相比均有下降，分別為(0.059 ±0.0049)(0.062 ±0.0033)，且有顯著性差異(P ＜0.05)。阿托伐他汀組吸光度也有下降(0.071±0.007)，但與腦脈泰組相比無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖4)。

圖4 腦脈泰對(duì)ApoE 敲除小鼠主動(dòng)脈根部MMP-2 表達(dá)的影響

2.4 中藥腦脈泰對(duì)動(dòng)脈斑塊MMP-9 表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果表明，模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)明顯較高。用Image-Pro plus 分析，陰性組的吸光度值比值為(0.00283 ±0.0003)，模型組的吸光度比值為(0.0987 ±0.000457)，而腦脈泰低高劑量組的吸光度比值與模型組相比均有下降，且有顯著性差異(P ＜0.05)，分別為(0.0605 ±0.000298)、(0.0475 ±0.00023)。阿托伐他汀組吸光度也有下降(0.05007 ±0.000535)，但與腦脈泰組相比無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖5)。

圖5 腦脈泰對(duì)ApoE 敲除小鼠主動(dòng)脈根部CD68 表達(dá)的影響

3 討論

從內(nèi)皮損傷到斑塊破裂，細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程中各個(gè)階段占據(jù)重要作用。基質(zhì)金屬蛋白酶是一種可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成分(膠原、明膠、彈性蛋白、纖維連接蛋白等)的鋅依賴性蛋白酶。它可在眾多細(xì)胞中產(chǎn)生，正常情況下基本不表達(dá)而在病理重塑過(guò)程中表達(dá)增多。在斑塊發(fā)展的起始階段，細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生代償性重塑。在動(dòng)脈粥樣硬化晚期，局部基質(zhì)金屬蛋白酶的過(guò)度表達(dá)和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)引起細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂，纖維帽變薄，引發(fā)斑塊的破損［3，4］，最終引發(fā)急性心血管事件。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成是一個(gè)平滑肌細(xì)胞的遷移過(guò)程，這個(gè)過(guò)程與基質(zhì)金屬蛋白酶密切相關(guān)，尤其是MMP-2 和MMP-9，它們可降解平滑肌細(xì)胞周圍的膠原破壞斑塊的穩(wěn)定性［5］。MMP-2 是一種分子量大小為72 kD，可降解膠原的基質(zhì)金屬蛋白酶。目前研究表明MMP-2 可降解細(xì)胞外基質(zhì)繼而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。MMP-2 在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破損處高表明MMP-2 參與單核細(xì)胞遷移至血管內(nèi)膜并影響巨噬細(xì)胞在血管內(nèi)膜的增殖［6］。Masafumi 等研究表明，MMP-2 敲除可導(dǎo)致ApoE-/-小鼠動(dòng)脈斑塊的破損，這種由MMP-2 誘導(dǎo)的斑塊不穩(wěn)定性可能是由于其促進(jìn)平滑肌細(xì)胞在纖維帽處累積引起的［7］。MMP-9 主要由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞合成并釋放，一般情況下以非活性酶原存在，端功能前區(qū)被蛋白酶剪切后激活。MMP-9 具有較強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)降解作用，可降解動(dòng)脈粥樣斑塊纖維帽的重要組分4 型膠原［8］，在炎癥反應(yīng)和血管再生中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)以高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組相比，ApoE基因敲除小鼠的主動(dòng)脈根部MMP-2 和MMP-9 表達(dá)均顯著性增多。給予腦脈泰后，主動(dòng)脈根部MMP-2和MMP-9 表達(dá)均顯著下降，并且與陽(yáng)性對(duì)照藥阿托伐他汀組比較無(wú)顯著性差異，這表明腦脈泰可能通過(guò)降低MMP-9 和MMP-2 的表達(dá)發(fā)揮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的保護(hù)作用。

動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊肩部富含巨噬細(xì)胞，極易發(fā)生破損［5］。CD68 是LAMP 家族的糖基化蛋白，在各組織的巨噬細(xì)胞表面均有表達(dá)，常用于巨噬細(xì)胞的組化標(biāo)記［9］。CD68 是臨床上炎癥和腫瘤的標(biāo)志。Ramprasad 等通過(guò)配體印跡法和親和純化法證明CD68 可與氧化低密度脂蛋白結(jié)合［10］，形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定的發(fā)展。宋京郁等通過(guò)對(duì)人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化標(biāo)本的CD68 分布的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈斑塊的肩部CD68 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞表達(dá)和纖維帽區(qū)壞死核心及其他部位有顯著差異，證明CD68 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞與人類動(dòng)脈粥樣硬化的病變發(fā)展和不穩(wěn)定斑塊的炎癥浸潤(rùn)繼而破損有關(guān)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，ApoE 基因敲除小鼠主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處CD68 表達(dá)顯著增多。而腦脈泰高低劑量組均可降低CD68 在斑塊處的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。阿托伐他汀組CD68 的表達(dá)與腦脈泰組無(wú)顯著性差異，這表明腦脈泰可能通過(guò)減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)以維持動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。

腦脈泰由田七、人參、丹參、銀杏葉等中藥組成。丹參酮具有抗炎和抗氧化作用，可以降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊MMP-2 的表達(dá)以維持動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性［12］。銀杏提取物銀杏內(nèi)酯B 可抑制血小板聚集和釋放，降低炎癥反應(yīng)，減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［13］。因此腦脈泰具抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理學(xué)基礎(chǔ)。阿托伐他汀可選擇性抑制HMG-CoA 還原酶，降低膽固醇和脂蛋白水平，臨床上常用于降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化。我們的研究結(jié)果表明，動(dòng)脈粥樣硬化情況下，內(nèi)膜明顯增厚，部分出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶，斑塊處MMP-2 和MMP-9、CD68 明顯表達(dá)，而腦脈泰膠囊和阿托伐他汀不僅可顯著減少動(dòng)脈斑塊的增厚程度，更降低上述炎癥因子的表達(dá)，且腦脈泰高低劑量組和阿托伐他汀組在降低程度上無(wú)顯著性差異，這表明腦脈泰可能激活了機(jī)體內(nèi)在保護(hù)作用，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，進(jìn)而減少動(dòng)脈斑塊的不穩(wěn)定性以發(fā)揮保護(hù)作用。

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