小白菊內酯對帕金森病MPTP 模型小鼠抗炎作用的研究

張 輝，陶建峰，王愛軍，孫 娜，王 茜

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種中樞神經系統變性疾病，病因及發病機制至今未明。有研究顯示炎癥反應與PD 發病密切相關［1，2］。環氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)與前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)作為炎癥反應的重要生物學指標［3］，有研究顯示其介導的炎癥反應可能參與PD 發病過程［4］。同時有報道PD 患者中腦黑質區存在誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide，iNOS)的高度活化，iNOS 在PD 發病中與炎癥關系密切，且可能起重要作用［5］。小白菊內酯作為艾菊的有效成分，具有抗氧化、抗炎、提高免疫力等作用［6，7］。有文獻報道，小白菊內酯對MPTP 致黑質區多巴胺(DA)能神經元的損傷具有一定的保護作用［8］。那么小白菊內酯是否可通過影響炎癥反應從而保護DA 能神經元，為明確此問題，本研究觀察小白菊內酯干預后小鼠黑質COX-2、PGE2、iNOS 表達變化的過程，探討小白菊內酯的抗炎作用及對DA 能神經元的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑MPTP(Sigma USA) 兔抗人COX-2單克隆抗體(福州邁新生物)，兔抗人PGE2 單克隆抗體(Cayman USA)，兔抗小鼠iNOS 單克隆抗體(福州邁新生物)，小鼠抗人TH 單克隆抗體(Chemicon USA)，UltraSensitive TMSP 超敏試劑盒(福州邁新生物)，預染蛋白Marker(天津灝洋生物公司)，小白菊內酯(Sigma 公司)。

1.2 實驗動物 健康雄性小鼠C57BL6 小鼠45 只，8～12 周齡，體質量25～30 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXX(京)2002-0003］，自由進食飲水，室溫(25 ±2)℃，單籠喂養，自然光照。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和模型制備 健康雄性C57BL6 隨機分為3 組，每組15 只。模型組:給予MPTP(30 mg/kg，鹽水溶，腹腔注射)，1 次/d，連續5 d。小白菊內酯干預組:除給予PD 組相同的MPTP 處理外，MPTP 注射前2 h 注射小白菊內酯(5 mg/kg，DMSO 溶，腹腔注射)，之后注射MPTP(30 mg/kg，鹽水溶，腹腔注射)，1 次/d，連續5 d。對照組:注射與PD 組和干預組等體積的鹽水。3 組小鼠均于MPTP 第5 次注射后24 h 處死。

1.3.2 標本采集 免疫組化:每組選擇9 只小鼠麻醉后，行40 g/L 多聚甲醛磷酸鹽緩沖液常規灌注固定，迅速開顱取腦，40 g/L 多聚甲醛后固定48 h(4 ℃)，石蠟包埋切片。Western blot:每組選擇6 只小鼠麻醉后取腦，分離中腦黑質部分，置入細胞裂解液中，低溫勻漿，4 ℃震蕩30 min 后，12000 轉4 ℃離心15 min，取上清，-80 ℃保存備用。

1.3.3 免疫組織化學檢測 腦組織切片常規脫蠟至水，后用TBST(pH7.4 ±0.2)洗滌;組織抗原行水浴法熱修復;3%過氧化氫阻斷內源過氧化物酶，正常非免疫動物血清室溫孵育10 min;同一組織相鄰切片分別加入一抗即兔抗人COX-2 單克隆抗體(1∶ 100)、兔抗人PGE2 單克隆抗體(1∶ 300)、兔抗小鼠iNOS 單克隆抗體(1∶ 100)、小鼠抗人TH單克隆抗體(1∶ 400)，4 ℃過夜;TBST 洗滌后，加入生物素標記二抗(1∶ 150)室溫孵育;TBST 洗滌，加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶室溫孵育20 min，DAB 顯色，中性樹膠封固，光鏡下觀察照相。

1.3.4 Western blot 取標本蛋白定量后加入4 倍體積樣本緩沖液，95 ℃變性5 min。取20 μg 樣品在100 g/L 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上電泳后，電轉至硝酸纖維素膜，以標準蛋白Marker 為參照，依分子質量大小切取條帶，取相應條帶分別加入COX-2 一抗(1∶ 400)、PGE2一抗(1∶ 600)、iNOS 一抗(1∶ 400)和TH 一抗(1∶ 1000)，4 ℃過夜，TBST 沖洗后，分別與生物素標記的羊抗兔/小鼠IgG 抗血清(1∶ 200)室溫震蕩孵育2 h，TBST 洗滌后，與卵白素-辣根過氧化物酶復合物室溫下孵育0.5 h，DAB 顯色。將特異性蛋白條帶掃描后，在同一條件下應用CMIAS 真彩醫學圖像分析系統測定條帶平均光密度值。

1.4 統計學處理 選定黑質所在區域，采用CMIAS 真彩色醫學圖像免疫組化自動分析系統進行陽性細胞計數。各組每只動物的3 張腦片數值相加后取平均值，實驗結果使用SPSS 13.0 統計軟件進行統計處理。分別采用單因素方差分析，q 檢驗，P ＜0.05 表示差異有統計學意義，以P ＜0.01 表示差異有顯著性。Western blot 數據統計分析同上。

2 結果

2.1 PD 模型復制成功 模型小鼠于第一次注藥后10～20 min 均出現不同程度的震顫、豎毛、翹尾，MPTP 最后一次注射后，模型小鼠出現步態蹣跚、活動減少、動作變慢等癥狀;對照組未出現上述行為學變化;小白菊內酯干預組與模型組比較上述行為學癥狀明顯減輕。

2.2 免疫組化檢測結果 對照組中腦黑質致密部可見大量TH 陽性神經元，且排列整齊，呈條帶狀，偶見COX-2、PGE2、iNOS 陽性細胞散在分布。模型組與對照組相比，TH 陽性細胞顯著減少約58%，黑質區可見大量COX-2、PGE2、iNOS 陽性細胞。干預組TH 陽性神經元的丟失較模型組明顯為輕，僅較對照組減少約27%，且黑質區COX-2、PGE2、iNOS 陽性細胞較模型組有顯著減少。干預組與對照組相比炎癥因子COX-2、PGE2、iNOS 表達增多不明顯。圖像分析結果顯示，模型組、干預組、對照組差異有統計學意義(P ＜0.01，見表1)。

2.3 Western blot 檢測結果 在預染蛋白標準約Mr 2000、72000、130000 和61000 處，分別可見PGE2、COX-2、iNOS 和TH 特異性蛋白條帶。圖像分析發現，模型組COX-2、PGE2、iNOS 的表達均明顯增高，TH 表達顯著降低，與對照組比較，光密度差異均有統計學意義(P ＜0.05，見表2);小白菊內酯干預組與模型組比較，COX-2、PGE2、iNOS 的表達均顯著降低，TH 表達降低程度減輕，差異有統計學意義(P ＜0.05，見表2);對照組僅有少量COX-2、PGE2、iNOS 的表達，干預組與對照組相比COX-2、PGE2、iNOS 表達增多不明顯。

表1 小白菊內酯干預組對黑質區COX-2、PGE2、iNOS 表達和TH 陽性細胞數的影響(n=9，)

與對照組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

表2 各組小鼠中腦黑質TH、COX-2、PGE2 和iNOS 蛋白表達水平(n=6，)

表2 各組小鼠中腦黑質TH、COX-2、PGE2 和iNOS 蛋白表達水平(n=6，)

與對照組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

3 討論

PD 主要病理特征為中腦黑質DA 能神經元進行變性缺失，其臨床表現有靜止性震顫、運動遲緩和姿勢步態異常等。本實驗復制的PD 模型小鼠具有典型的行為學表現;實驗結果顯示中腦黑質致密部TH 免疫陽性細胞明顯減少，中腦黑質TH 蛋白表達下降，這提示本實驗動物中腦黑質存在DA 能神經元大量丟失，上述結果說明，本實驗PD 模型復制成功［9］。

有研究發現，PD 患者黑質致密部DA 能神經元大量丟失，伴有小膠質細胞活化增生和致炎性因子高表達［10］;模型動物中腦黑質紋狀體系統存在PGE2、iNOS、TNF-α 等炎癥因子高表達，且炎性因子表達量與DA 能神經元數量存在負相關關系;抗炎性藥物可顯著減少PD 模型動物膠質細胞增生、致炎性因子表達和DA 能神經元丟失［11］。這提示，炎癥反應可能在PD 發病中起重要作用。同時iNOS 作為炎癥的反應性酶類，其表達與神經元損傷。本室前期研究也表明，炎癥介質PGE2 的關鍵限速酶COX-2以及炎癥因子iNOS 在MPTP 所致PD 動物模型DA能神經元丟失過程中發揮重要作用［4］。為證實MPTP 模型中炎癥反應與DA 能神經元變性丟失的關系，本實驗檢測了COX-2、PGE2 和iNOS 在小鼠模型中腦黑質中的表達情況，結果發現在小鼠模型建立成功之后，COX-2、PGE2 和iNOS 陽性細胞顯著增多，同時伴有TH 陽性細胞的顯著減少，提示COX-2及iNOS 介導的炎癥反應的加劇有可能參與造成黑質區DA 能神經元大量變性缺失。

有文獻報道，小白菊內酯具有抗炎、抗氧化等功能，并對MPTP 致黑質區DA 能神經元的損傷具有一定的保護作用［6，7］。本研究觀察小白菊內酯干預后小鼠黑質COX-2、PGE2 和iNOS 陽性細胞及蛋白水平較模型組有明顯減少，相應的黑質區TH 陽性細胞和蛋白水平較模型組降低程度減輕。這提示小白菊內酯可在一定程度上影響COX-2、PGE2 和iNOS 表達，從而減輕黑質區的炎癥反應，使黑質DA 能神經元免于MPTP 誘導的損傷，對DA 神經元起到一定保護作用，最終使該模型小鼠運動功能障礙得以改善。

本研究表明，COX-2 和iNOS 導致的炎癥反應可能參與造成PD 病DA 能神經元的變性缺失;小白菊內酯可通過影響COX-2、PGE2 和iNOS 的表達，起到抗炎作用進而對小鼠多巴胺能神經元起到一定的保護作用。

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