尤瑞克林對缺血再灌注大鼠腦神經生長因子表達的影響

李國前，王杰華，楊小霞，潘 瑩，陳淑增，許秀秀

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是一種具有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能的神經細胞生長調節因子，對中樞神經系統的再生和修復有著重要的作用［1，2］，探索NGF 的表達機制對于治療神經損傷具有重要意義。尤瑞克林是近年研制的國家一類新藥，對急性腦血管病具有顯著的治療作用［3］，目前作用機制未完全明確。本實驗探討尤瑞克林對大鼠腦缺血再灌注損傷后大腦皮質NGF 表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 成年雄性SD 大鼠24 只，體重250～300 g，福建醫科大學實驗動物中心提供。注射用尤瑞克林(0.15 PNA 單位/瓶)，廣東天普生化醫藥股份有限公司;Trizol 試劑，美國Invitrogen 公司;逆轉錄試劑盒及PCR 試劑盒，加拿大MBI Fermentas公司;兔抗大鼠NGF 抗體，武漢博士德生物工程有限公司;即用型免疫組化試劑盒(鼠/兔)，福州邁新生物技術開發有限公司;β-actin 和辣根酶標記IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司;Beyo ECL，Western 熒光檢測試劑，中國碧云天生物技術公司。

1.2 動物分組與給藥 實驗大鼠隨機分為3組:假手術組(sham 組)、模型組(model 組)和實驗組(test 組)，每組8 只。實驗組于再灌注后5 min 靜脈注射用滅菌生理氯化鈉溶液稀釋的尤瑞克林3.5×10-3PNAU/kg，給藥體積1 ml/kg。假手術組和模型組正常喂養。

1.3 模型制備 模型組和實驗組參考改良Zea-Longa 線栓法［4］制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。血流阻斷2 h 后拔出線栓，形成再灌注。假手術組大鼠接受相似手術處理，但是不插入線栓。再灌注48 h 后處死動物斷頭取腦，取右側大腦半球視交叉后6～11 mm 的缺血側腦組織皮質區備用。

1.4 半定量PCR 法檢測NGF mRNA 的表達NGF 上游引物為:5’-tccacccacccagtcttcca-3’，下游引物為:5’-gccttcctgctgagcacaca-3’(擴增產物344 bp);β-actin 上游引物為:5’-attgtaaccaactgggacg-3’，下游引物為:5’-tctccagggaggaagagg-3’(擴增產物490 bp)。取缺血側腦組織按Trizol 法提取總RNA并進行逆轉錄反應。PCR 擴增反應條件為:變性94 ℃30 s，退火64 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，反應循環數為34。反應完畢后擴增產物進行電泳，半定量分析電泳條帶的吸光度，結果以目的基因與β-actin吸光度的比值表示。

1.5 免疫組織化學法檢測NGF 的表達 大鼠腦組織切片經脫臘至水，室溫孵育5～10 min，高壓修復2～5 min;加入一抗兔抗大鼠NGF 抗體(工作濃度約為1∶ 100)，4 ℃濕盒孵育過夜;再加入滴加生物素化小鼠抗兔的二抗，室溫30 min，AEC 顯色10～20 min(顯微鏡下控制顯色程度);自來水充分沖洗，終止反應，蘇木素復染;滴加水性封片劑，干燥后中性樹膠封片。各步驟間用0.01 mol/L PBS 沖洗。陽性細胞計數:在400 倍光學顯微鏡下分別隨機選取5 個視野，分別計數免疫反應陽性的細胞數。

1.6 Western blot 法檢測NGF 蛋白的表達取缺血側腦組織100 mg 置于玻璃勻漿器中，加入裂解液，嚴格按照說明書進行蛋白提取，然后采用BCA法測定蛋白濃度。取25 μg 蛋白，變性后垂直電泳，電轉至PVDF 膜，用含10%脫脂奶粉的TBS 室溫封閉2 h，分別加入一抗(兔抗大鼠NGF 抗體，1∶ 1000;兔抗大鼠β-actin 抗體，1∶ 1000)，4 ℃孵育過夜，用含0.1% Tween-20 的TBS 洗滌3 次，然后與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶ 2000)室溫孵育1 h，重復洗滌3 次，最后用ECL 液顯色，X 片顯影、定影。采用Image J 圖像分析測定Western blot 條帶灰度值，結果以NGF 與β-actin 灰度值的比值表示。

1.7 數據統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件進行單因素方差分析，結果用均數±標準差()表示，P ＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠NGF mRNA 的表達變化 假手術組NGF mRNA 有微弱的表達(0.11 ±0.03)。模型組NGF mRNA 表達較假手術組顯著增高(0.32 ±0.05)，差異有統計學意義(P ＜0.05)。實驗組NGF mRNA 表達較模型組顯著增高(0.70 ±0.08)，差異有統計學意義(P ＜0.05)(見表1、圖1)。

2.2 各組大鼠NGF 陽性細胞的表達變化 假手術組僅見少量NGF 陽性細胞表達(8.42 ±1.85);模型組NGF 陽性細胞表達較假手術組顯著增多(24.51±5.29)，差異有統計學意義(P ＜0.05);實驗組NGF 陽性細胞表達較模型組顯著增多(38.46 ±6.10)，差異有統計學意義(P ＜0.05)(見表1、圖2)。

2.3 各組大鼠NGF 蛋白的表達變化 假手術組NGF 蛋白有微弱的表達(0.13 ±0.02);模型組NGF 蛋白表達較假手術組顯著增多(0.34 ±0.06)，差異有統計學意義(P ＜0.05);實驗組NGF 蛋白表達較模型組顯著增多(0.45 ±0.08)，差異有統計學意義(P ＜0.05)(見表1、圖3)。

表1 各組大鼠NGF 表達的比較(n=8，)

表1 各組大鼠NGF 表達的比較(n=8，)

與假手術組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

圖1 各組大鼠缺血區腦組織NGF mRNA 的表達

圖2 各組大鼠缺血區腦組織NGF 陽性細胞的表達(×400)

圖3 各組大鼠缺血區腦組織NGF 蛋白的表達

3 討論

NGF 是神經系統最主要的神經營養因子，與其高親和性膜受體TrkA 結合后，經胞內的一系列信號轉導途徑，在神經元的發育、軸突的生長、遞質的合成以及細胞的凋亡等各個階段均發揮著重要的作用［5］;同時參與了調節交感、感覺神經元的分化和成熟的過程，具有促進神經元的生存，調節突觸效力和可塑性的作用［6，7］。有許多研究表明，腦缺血再灌注損傷后具有自我修復的潛力，且其修復與非神經元區的神經再生以及NGF 的表達有著密切的關系［8，9］。NGF 的分子量很大難以透入血腦屏障，直接給予外源性NGF 治療腦缺血損傷難以湊效;而內源性NGF 在腦缺血損傷發生時維持時間短，而且表達水平有限，難以對受損神經元起到全面、持久的保護作用。因此給藥途徑和藥物合成是今后研究的重點所在。本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，結果發現，腦缺血再灌注損傷后，模型組大鼠大腦皮質NGF 表達較假手術組升高，提示機體可促進NGF 的應激性表達上調，改善神經元的病理狀態，減輕神經損害［10］。

尤瑞克林是人尿激肽原酶，是激肽原酶-激肽系統中的重要組成部分。激肽原酶作用于激肽原，使其釋放出激肽，激肽與激肽受體結合，從而產生一系列的生理作用［11］?；A研究表明，腦組織缺血損傷后，整個激肽原酶-激肽系統，包括激肽原酶、激肽均會一過性地升高，激肽受體表達也上調，表明激肽原酶-激肽系統參與腦缺血病理生理過程［12］。藥效學研究顯示尤瑞克林可明顯提高缺血腦組織的血管儲備功能，增加局部血流灌注量，改善腦微循環;促進損傷部位新生血管生成、抑制細胞凋亡;增加紅細胞變形能力和氧解離能力;抑制血小板聚集和血液凝固，從而改善腦梗死患者的預后［13］。在腦缺血動物模型的研究中發現:側腦室轉尤瑞克林能夠減小梗死體積、減少細胞凋亡、減弱氧化應激反應、增加細胞的存活和遷移;缺血后應用外源性尤瑞克林可以增加缺血組織血管新生和神經再生［11］。本實驗對大鼠腦缺血再灌注損傷后予尤瑞克林進行干預，結果發現，實驗組大鼠大腦皮質NGF 表達較模型組進一步升高，證實尤瑞克林對改善NGF 的表達有較好的作用，從而對神經元的功能具有較好的保護作用。

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