大鼠腦橋呼吸調整中樞神經元對低氧呼吸反應的調節作用

汪慧，楊俊卿，槐瑞托

(山東科技大學，山東青島266590)

低氧呼吸反應是指在低氧環境中呼吸運動的適應性變化。在哺乳動物，急性低氧導致雙相呼吸反應，即起始階段的呼吸運動增強并達高峰和隨后的逐漸減弱但持續高于常氧呼吸水平至低氧結束［1］，急性低氧刺激結束后，呼吸頻率即刻下降至低于低氧刺激前水平，此現象稱為低氧后呼吸頻率下降(PHFD)［2，3］。1923年Lumsden通過實驗提出腦橋呼吸調整中樞的概念［4］。背側腦橋是傳統意義上的腦橋呼吸調整中樞，主要結構是 KF核及 PB核［5～9］。研究表明，腦橋呼吸調整中樞對急性低氧引發的外周化學感受器反射的呼氣或頻率成份具有特異性影響［10，11］。2012年3月～2013年5月，我們系統觀察了大鼠背側腦橋N-甲基-D-天氡氨酸(NMDA)受體及γ-氨基丁酸(GABA)受體對低氧呼吸反應的作用，為進一步研究腦橋的呼吸調控功能提供了新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠20只，體質量250～450 g。所有動物手術過程和飼養方法符合世界腦研究組織發布的實驗動物使用條例。

1.2 主要試劑 NMDA受體阻斷劑D-2-氨基-5-磷酸基戊酸(D-AP5)和GABA受體阻斷劑荷包牡丹堿(BIC)均為美國Sigma公司產品，D-AP5及BIC溶于人工腦脊液，稀釋至10 mmol/L，注射劑量為20～50 nL。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備 30%的氨基甲酸乙酯(1.5 g/kg)腹腔麻醉，皮下注射阿托品(0.1 mg/kg)減少呼吸道內腺體分泌，腹側頸部游離并切斷雙側迷走神經及C5膈神經。將神經浸潤于液體石蠟中。股動脈及股靜脈分別用于監測血壓及靜脈給藥。三碘季銨酚(Sigma公司)肌松，氣管插管接呼吸機給予人工通氣。CO2監測儀持續監測終末呼出氣CO2分壓并使其維持在5%～5.5%。根據大鼠腦圖譜［12］，將動物的頭部以俯臥位固定于立體定位儀上，使前囟高于后囟約1.5 mm以便于電極插入。切開后囟附近的皮膚及其他組織，暴露顱骨，在后囟附近耳尖水平中線矢狀縫一側用電鉆鉆開一直徑約5 mm的孔，去掉硬腦膜，暴露腦組織。所有暴露組織用液體石蠟覆蓋。膈神經置于雙極銀絲電極，放電經CyberAmp380生物放大器放大后引入NI-DAQ數據采集卡(NI公司，美國)，通過Labview軟件采樣(10 kHz)記錄，同時膈神經放電輸入積分儀。

1.3.2 注射部位及方法 注射之前，先將鎢絲微電極植入背側腦橋(前囟后9.5～10 mm，中線旁開2.2～2.4 mm，背側表面深入7.7～8.7 mm)內，給予電刺激，出現呼吸抑制效應的區域確定為注藥位點。刺激參數:20～50 μA，頻率80 Hz。使用PPM-2微量注射系統分別向背側腦橋壓力注射D-AP5(DAP5組，n=5)、BIC(BIC組，n=5)20～50 nL。向背側腦橋KF核以相同速度注射同等劑量、pH值和滲透壓的人工腦脊液作為對照組，以排除注射速度、濃度、pH值、滲透壓對實驗結果的影響。在背側腦橋以外的區域(電刺激不引起呼吸抑制效應)微量注射D-AP5、BIC作區域對照。

1.3.3 低氧刺激方法 將人工通氣氣體從21%O2切換至8%O2(N2平衡)30～50 s。對照組給予低氧刺激前先記錄1 min的膈神經放電作為基線，低氧刺激后再記錄5 min作為后對照。向背側腦橋分別微量注射D-AP5及BIC 20～50 nL，2 min后，給予8%O230～50 s，微量注射后90 min，待膈神經放電恢復到前對照水平再次給予8%O230～50 s。

1.3.4 指標觀察方法 采用自編Matlab軟件測量膈神經放電幅度(AMP)、吸氣時間(Ti)、呼氣時間(Te)，以60/(Ti+Te)為某呼吸周期的瞬時呼吸頻率(f)。取急性低氧刺激前，對照組(1 min)內的平均AMP、Ti、Te、f的基線值。以基線值為標準對各個呼吸周期的AMP、Ti、Te、f進行標準化。以Te為例:標準化Te=［(Te-Te基線值)/Te基線值］+ 1。數據統計分4個時期，分別是前對照(低氧刺激前對照記錄1 min期間平均呼吸參數);急性低氧期(低氧開始后20～30 s期間平均呼吸參數);PHFD期(低氧通氣結束恢復正常通氣后前10 s期間平均呼吸參數)以及后對照(低氧通氣結束后6～7 min期間平均呼吸參數)。統計各階段平均AMP、Ti、Te、f的測量值(絕對值)及標準化值。

1.3.5 統計學方法 采用自編Matlab軟件。計量資料用s表示，組間比較采用Student's t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D-AP5對低氧呼吸反應的作用結果 與對照組比較，D-AP5組急性低氧反應期膈神經f、Te、Ti及AMP變化無明改變(P均＞0.05);但PHFD期膈神經放電Te延長幅度及f下降幅度明顯減小(P均＜0.05)，PHFD現象削弱。見表1。

表1 微量注射AP5前后兩組低氧反應各指標改變情況比較(n=5，s)

表1 微量注射AP5前后兩組低氧反應各指標改變情況比較(n=5，s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別 f(%)Te(%)Ti(%)AMP(%)急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期對照組 18.28±0.02 35.19±0.08 13.98±0.02 93.25±0.25 15.78±0.07 16.09±0.08 15.78±0.07 16.09±0.08 AP5組 16.33±0.04 17.89±0.07* 10.32±0.06 52.98±0.18* 20.46±0.07 27.31±0.10 20.46±0.07 27.31±0.10

2.2 BIC對低氧呼吸反應的作用結果 與對照組比較，BIC組急性低氧反應期膈神經放電f升高的幅度、呼氣時間縮短的幅度均明顯增大(P均 ＜ 0.05)，PHFD期膈神經放電無顯著性變化(P均＞0.05)。見表2。

表2 微量注射BIC前后兩組低氧反應各指標改變情況比較(n=5，s)

表2 微量注射BIC前后兩組低氧反應各指標改變情況比較(n=5，s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別 f(%)Te(%)Ti(%)AMP(%)急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期對照組 25.49±0.02 36.65±0.07 24.43±0.02 89.57±0.21 5.66±0.02 21.8±0.05 8.14±0.04 17.14±0.06 BIC組 37.96±0.05* 29.41±0.09 31.29±0.04* 74.14±0.25 7.20±0.03*16.90±0.03 10.71±0.06 17.57±0.12

3 討論

外周化學感受器反射是中介低氧呼吸反應的主要因素。存在于頸動脈體和主動脈體的外周化學感受器將刺激信息經竇神經和迷走神經傳入［13～15］，止于延髓的孤束核［13］。我們實驗室通過c-Fos蛋白免疫組織化學方法及CTB逆行標記方法研究了孤束核到腦橋背側的功能通路。在腦橋背側注射CTB可以在孤束核觀察到逆行標記神經元。低氧刺激可以使部分逆行標記神經元表達c-Fos蛋白［13］。這表明低氧激活孤束核神經元，即外周化學感受器二級或更高級中繼神經元。它們的軸突或軸突分支投射到并終止于背側腦橋。我們還采用逆行興奮方法研究了孤束核低氧敏感神經元向腦橋背側區域的軸突投射。我們在大鼠孤束核共記錄到30個神經元單位放電可被電刺激背側腦橋逆行興奮，逆行興奮潛伏期在1.5～3.5 ms，平均2.4 ms。其中半數逆行興奮神經元又可被低氧刺激興奮［16］。

另一項研究發現，背側腦橋的PB核選擇性中介低氧呼吸反應的頻率成份［10］。電損毀或化學損毀PB核后給予低氧刺激，低氧時呼吸頻率升高的幅度降低了70%～80%，這主要是由于呼氣時程縮短的幅度降低導致的。低氧時吸氣時程縮短、吸氣幅度增大及低氧后呼吸頻率下降的現象沒有明顯變化。我們實驗結果顯示，在背側腦橋，NMDA受體主要參與了PHFD現象的調控，GABA受體主要參與急性低氧時呼吸頻率的調控。腦橋呼吸調整中樞通過整合來自于外周化學感受器的傳入信息調節外周化學感受器所中介的低氧呼吸反應的頻率成份。

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