氨基胍在大鼠骨骼肌缺血再灌注肺損傷中的作用機制

張彥榮，王志波，畢偉，張文濤，呂璐

(1河北醫科大學第二醫院，石家莊050000;2河北醫科大學基礎醫學院; 3中山大學中山醫學院)

骨骼肌缺血再灌注損傷在臨床上很常見，再灌注損傷不僅可以導致局部組織第二次打擊，還能導致遠隔器官(如腎、肺等)的繼發性的損傷［1］。細胞間黏附分子1(ICAM-1)屬免疫球蛋白超家族成員，介導中性粒細胞與血管內皮細胞黏附及中性粒細胞穿過血管壁的過程，是缺血再灌注損傷中的重要的炎性介質，可激活一氧化氮合酶(iNOS)產生大量的一氧化氮(NO)，造成組織損傷［2］。氨基胍(AG)是iNOS的抑制劑，研究表明，AG主要通過抑制iNOS的活性進而減少NO的產生而起作用［3］。2013年1～5月本實驗采用AG進行治療，通過觀察ICAM-1、NO的變化及肺組織損傷情況，進一步探求AG在骨骼肌缺血再灌注肺損傷中作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wister大鼠24只，體質量200 g左右，由本校實驗動物中心提供。AG購自Sigma公司，ICAM-1免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，NO、乳酸脫氫酶(LDH)、髓過氧化物酶(mpo)，檢測試劑盒購自碧云天生物工程有限公司，Trlzol RNA提取試劑Invitrogen公司產品;逆轉錄酶(M-MLV)、核糖核酸酶抑制劑、dNTP、Taq DNA聚合酶、隨機引物及瓊脂糖均為美國Promega公司產品;熒光定量試劑盒購自BBI公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將24只大鼠隨機分為4組，每組6只，Ⅰ組為對照組，僅進行常規麻醉，不阻斷后肢血流(10 h后取材);Ⅱ組為缺血組，即阻斷后肢動脈致缺血4 h，不行再灌注;Ⅲ組為I/R組，即阻斷后肢動脈致缺血4 h再灌注6 h;Ⅳ組為I/R+AG組，即阻斷后肢動脈致缺血4 h再灌注6 h，再灌注開始時經尾靜脈注射AG注射液(150 mg/kg)［4］。

1.2.2 模型制備方法 20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，止血帶捆扎兩側大腿根部，使兩后肢缺血4 h后去除止血帶實現再灌注［5］，各組設定時間處理動物，分別取材。

1.2.3 血清LDH、NO及肺組織MPO檢測 各組大鼠實驗結束時經心臟穿刺取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清LDH含量，用Bio Tek ELX800酶標儀嚴格按照NO檢測試劑盒進行NO檢測，取肺組織勻漿并用ELISA檢測試劑盒檢測肺組織中MPO含量。

1.2.4 肺組織ICAM-1蛋白表達檢測 對4組肺組織進行免疫組化染色，肺泡上皮細胞胞質內出現淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細胞。ICAM-1陽性判斷標準參考文獻［6］。計數5個高倍視野，按照染色強度計分:0分為無著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色;按陽性細胞所占百分比計分:無陽性細胞計0分，≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，＞76%計4分;二者計分相乘0～2分為(－)，≥3分為(+)。

1.2.5 肺組織ICAM-1基因表達檢測 采用RTPCR法檢測 4組肺組織 ICAM-1基因的相對表達量。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。實驗數據以s表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步組間比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清LDH、NO及肺組織MPO比較 見表1。

表1 各組大鼠血清LDH、NO及肺組織MDO比較(s)

表1 各組大鼠血清LDH、NO及肺組織MDO比較(s)

注:與Ⅰ組比較，*P＜0.05;與Ⅲ組比較，△P＜0.05。

Ⅰ組＊△

2.2 各組肺組織ICAM-1蛋白表達比較 Ⅰ組肺泡上皮細胞未見陽性表達;Ⅱ組肺泡上皮細胞呈淡黃色顆粒狀;Ⅲ組肺泡上皮細胞見棕褐色顆粒，呈強陽性表達;Ⅳ組陽性產物表達明顯減輕。見插頁Ⅲ圖7。

2.3 各組ICAM-1基因在肺組織中相對表達量比較 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ICAM-1基因相對表達量分別為0.75±0.18、4.0±0.56、13.6±1.56和6.99± 1.59。Ⅰ組ICAM-1表達不明顯，在Ⅱ、Ⅲ組呈上升趨勢，Ⅳ組表達下調，其余3組與I組比較，差異有統計學意義(P均＜0.05);Ⅳ組與Ⅲ組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

目前認為，缺血再灌注導致肺損傷的機制之一為依賴中性粒細胞的途徑［7］。ICAM-1介導白細胞與血管內皮細胞相互黏附，是白細胞聚集、活化和釋放炎性介質的關鍵［8］。在組織缺血再灌注情況下，大量的過氧化物和超氧自由基產生，而自由基和NO是缺血再灌注損傷中的重要因素［9］，二者可激活NF-κB信號轉導通路，NF-κB具有與某些基因啟動子區的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄的功能，涉及各種信號機制的激活以及相應的細胞效應的產生［10］。造成包括ICAM-1在內的炎性介質的大量表達，使中性粒細胞與血管內皮細胞發生黏附，且穿越血管內皮細胞到達周圍組織，產生炎癥反應。中性粒細胞中存在MPO，每個細胞中所含的酶的量是一定的，MPO是中性粒細胞標志性的酶，因此，組織中MPO可反映中性粒細胞的浸潤程度［11］。

本研究中，在缺血組及缺血再灌注組，肺組織MPO量及ICAM-1表達增強，說明缺血再灌注肺損傷時，中性粒細胞及炎性因子作用存在。iNOS是催化合成一氧化氮的酶，左旋精氨酸在iNOS的催化下合成NO，它與活性氧自由基反應生成具有細胞毒性的超氧亞硝酸離子(ONOOˉ)，對組織器官造成損害。AG是iNOS的抑制劑，可使iNOS活性降低，進而減少NO等氧自由基的產生［12］。本研究發現，AG治療組不但血清中NO量下降，而且ICAM-1的表達及相對表達量均下降，因此可以推斷，骨骼肌缺血再灌注肺損傷時AG可能通過減少氧自由基的產生，部分地阻止了炎癥反應的發生，打斷了炎癥介質的級聯反應，使ICAM-1的表達下降，從而減輕了肺臟的缺血再灌注損傷。

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