濃香型白酒窖泥放線菌的群落結構及其多樣性

劉茂柯，唐玉明，趙 珂，任道群，姚萬春，田新惠

1 四川省農業科學院水稻高粱研究所生物中心，瀘州 646100 2 四川農業大學資源環境學院，溫江 611130

濃香型白酒窖泥放線菌的群落結構及其多樣性

劉茂柯1,*，唐玉明1，趙 珂2，任道群1，姚萬春1，田新惠1

1 四川省農業科學院水稻高粱研究所生物中心，瀘州 646100 2 四川農業大學資源環境學院，溫江 611130

以瀘州老窖1、50、100 和400 年窖泥為研究對象，采用變性梯度凝膠電泳(DGGE) 研究濃香型白酒窖泥放線菌的群落結構及其多樣性。DGGE 圖譜顯示，除1 年樣品外，其余窖底泥多樣性指數(H) 均低于同窖齡窖壁泥，但均勻度指數(EH) 較高。不同窖池相同部位窖泥的群落結構變化趨勢為：隨窖齡的延長，窖壁泥H值逐漸上升，為1.74—2.28；窖底泥下降，為1.73—2.07。EH值均為波動下降，分別在0.986—0.991 和0.971—0.994 之間。窖底泥相似性系數(SC) 逐漸上升，為0.46—0.82；窖壁泥為0.31—0.62。DGGE 條帶測序結果顯示，窖泥放線菌歸于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium4 個屬。Olsenella和Atopobium屬為共有的優勢屬，且在窖壁泥中的優勢度(di) 均隨窖齡延長而降低，在窖底泥中升高。實驗結果表明，濃香型白酒窖泥蘊藏著豐富的放線菌資源，群落結構和多樣性存在差異，菌群演替呈現一定規律性。

窖泥；放線菌；群落結構；演替；變性梯度凝膠電泳

濃香型白酒深受廣大消費者喜愛，其釀造生產依靠窖泥微生物的協同作用[1]。揭示窖泥微生物群落結構及其多樣性可為釀酒功能微生物的系統選育，人工窖泥配方的優化改良提供理論依據。放線菌是與人類生活密切相關的一類特殊細菌，其代謝產物一直是食品、醫學工業的研究熱點。已有研究顯示，放線菌可能促進濃香型白酒主體香味物質的形成[2]。但目前對窖泥放線菌的研究仍然較少，對其系統發育、多樣性結構亦鮮有報道。這必將弱化對濃香型白酒發酵機理的正確認識。

近年來，以PCR 為基礎的免培養技術已成為現代微生物生態學研究的重要手段，在對極端環境群落結構的監測方面具有傳統方法不具備的優勢[3]。因此，本研究采用PCR-DGGE 分析濃香型白酒窖泥放線菌的群落結構及其多樣性，以期為相關研究的深入奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

瀘州老窖1、50、100 和400 年窖池的窖壁泥和窖底泥。窖壁泥取樣方法是從窖池四壁中心的一點各取50 g 窖泥，混合均勻。窖底泥為窖底四個角落和中心的一點各取50 g 窖泥，混合均勻。樣品冷凍密封保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥樣品預處理及總DNA 的提取

按黃永光等[4]的方法進行樣品預處理后提取總DNA。用DNA 純化試劑盒 (上海生工)純化總DNA 后，于-20 ℃ 保存備用。

1.2.2 放線菌16S rRNA 基因的PCR 擴增

首先采用引物F243 和R1378 進行擴增，再以PCR 產物的10 倍稀釋液為模板，使用F984-GC 和R1378 進行嵌入式擴增[5]。反應體系(50 μL)：10×緩沖液2 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL) 2 μL，BSA(25 mg/mL) 2.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補足50 μL。兩輪PCR 程序相同，參照李小林等[6]的方法進行。用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。

1.2.3 擴增產物的DGGE 與測序

PCR 產物采用Bio-Rad 變性梯度凝膠電泳儀進行分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性范圍40%—70%。使用1×TAE 緩沖液，100 V 電泳10 min 進膠，再在70 V、60 ℃ 條件下電泳12 h，銀染法染色[7]，最后用數碼相機照相。將DGGE 圖譜上的主要條帶切膠回收，用F984 和R1378[5]引物對片斷進行PCR 擴增后克隆測序。

1.2.4 DGGE 圖譜分析

DGGE 圖譜用Quantity One 4.1.1 軟件(Bio-Rad) 分析，測定圖譜條帶數與光強度，計算條帶優勢度指數(di)、多樣性指數(H)、均勻度指數(EH) 和群落結構相似性系數(SC)[8]。

H=-∑Pi·lnPi(Pi=Ni/N)
EH=H/lnS
di=Pi=Ni/N

式中,Ni為DGGE 圖譜中條帶i的光強度；N為所有條帶的光強度之和；S為條帶數目。

1.2.5 系統發育分析

將序列通過DNAMAN 進行處理，用BLAST 將序列與GenBank 數據庫進行相似性比較，獲得相近模式菌株序列，用MEGA 5.0 中Neighbor-Joining 法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 窖泥放線菌16S rRNA 基因的PCR 擴增

圖1 窖泥放線菌16S rRNA 基因的PCR 產物電泳圖譜 Fig.1 Electrophoresis graph of the amplified 16S rRNA fragments from pit mudM：DL2000 Marker；圖中數字1—4 代表1、50、100 和 400 年窖壁泥；5—8 代表1、50、100 和 400年窖底泥

窖泥總DNA 經PCR 擴增后獲得放線菌的16S rRNA 基因目的片斷，經1% 瓊脂糖電泳檢測，得到的片段大小約為400 bp (圖1)。

2.2 DGGE 圖譜

圖2 窖泥放線菌16S rRNA 基因片段的DGGE 圖譜 Fig.2 DGGE patterns of 16S rRNA gene extracted from Actinobacteria in the pit mudM：DL2000 Marker；圖中數字1—4 代表1、50、100 和 400 年窖壁泥；5—8 代表1、50、100 和 400年窖底泥

圖2為窖泥放線菌16S rRNA 基因片段的DGGE 圖譜。各樣品PCR 產物經DGGE 分離后共得到17 條不同位置的條帶。B1—B10 為本實驗的測序條帶。其中，B3、B5 和B10 為所有樣品共有，表明不同窖泥的主要條帶一致，放線菌群落結構具有相似性。其余條帶為部分樣品所有，其中B9 僅在50a以上窖壁泥中檢出，B7、B8 在100a以上窖底泥中檢出，說明群落結構因窖池窖齡和部位的不同而存在差異。這可能導致釀造白酒的酒質不同。

2.3 優勢度(di) 分析

優勢度(di) 反映某物種在所有物種中所占的數量比例。結果顯示，DGGE 圖譜上每一條帶在不同樣品中的di值差異較大，但共有條帶B3、B5 和B10 的di值在不同樣品中均維持較高水平，表明它們代表窖泥中的優勢菌群。對于窖壁泥樣品，以上條帶di值隨窖齡延長而逐步降低；在窖底泥中，B3、B5 逐漸上升，B10 則表現出先降后升的趨勢(圖3)。此結果揭示，窖泥放線菌群落結構的演替可能具有一定的規律。

2.4 多樣性指數(H) 和均勻度指數(EH)

多樣性指數(H) 主要基于物種數量反映生態環境中的物種多樣性，均勻度指數(EH) 反映物種的分配情況。結果如圖4所示，不同樣品H和EH值存在一定差異。但同窖齡樣品中，除1a樣品外，其余窖底泥H值較低，EH值較高。不同窖齡樣品中，相對1 年窖壁泥(1.74)，50a窖壁泥H值(2.16) 有明顯上升，隨后上升程度減小；100 和400 年間無明顯變化，分別為2.28 和2.27。窖底泥H值則隨窖齡延長而平穩下降，維持在1.73—2.07 之間。另一方面，窖壁和窖底泥EH值均隨窖齡延長而波動下降，分別為0.986—0.991 和 0.971—0.994。窖底泥的波動幅度較大，且以1到50年的變化最明顯。

圖3 不同窖齡窖泥主要條帶的優勢度變化Fig.3 Changing laws of dominant degree of the main bands in the pit with different ages

圖4 不同窖齡窖泥的多樣性指數和均勻度指數 Fig.4 Shannon-weaver index and evenness for the pit with different ages

此結果提示，在窖泥老熟過程中，窖壁泥放線菌主要表現為新種屬的生長；窖底泥主要為原種屬的消亡。在此過程中，1到50年間放線菌群落結構變化較大。

2.5 窖泥放線菌群落結構相似性(SC) 分析

圖5 窖泥放線菌群落結構相似性樹狀圖 Fig.5 Dendrogram of homology coefficient of Actinobacteria in the pit mudM：DL2000 Marker；圖中數字1—4 代表1、50、100 和 400 年窖壁泥；5—8 代表1、50、100 和 400年窖底泥

群落結構相似性系數(SC) 反映不同樣品菌群種類的相似程度。窖泥放線菌SC結果見圖5。由圖可知，當SC值小于0.53，窖泥樣品分為3 個大族。3 號樣品單獨為一個族；2、4 和5 號為第二族，其余樣品為第三族。其中，窖底泥SC值較高，相近窖齡樣品SC值隨窖齡延長而上升，為0.46—0.82；其次是窖壁泥，為0.31—0.62；同窖齡樣品SC值較低，為0.31—0.46。結果說明，窖泥空間分布可能是影響放線菌種類差異的主要原因。在窖泥老熟過程中，窖底泥菌群種類逐漸穩定。

2.6 系統發育分析

序列同源性結果顯示，序列B5、B9、B10 和最似模式菌株OlsenellaprofusaCCUG 45371T、CorynebacteriumminutissimumNCTC 10288T、AtopobiumparvulumVPI 0546T的同源性較低，分別為95%、90% 和93%。其余序列和最似模式菌株同源性為97%—100%。

系統發育分析結果如圖6 所示，所有序列大致聚為3個族。B1、B2、B4 與Streptomyces屬模式菌株聚在第1個族；B3、B5、B10和Olsenella屬以及Atopobium屬聚在第2個族，并以與Olsenella屬的同源性較高；其余序列與Corynebacterium屬聚在第3個族。結果顯示窖泥放線菌可歸屬于以上4 個屬，具有一定的多樣性。

圖6 部分放線菌DGGE 條帶系統發育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of Actinobacteria from DGGE bands

3 討論

傳統觀點認為，放線菌在濃香型白酒釀造中的作用有限，使得相關研究一直未受重視。有關窖泥放線菌多樣性的研究僅見于張超等[9]在2011 年的報道。他們采用平板法從多糧濃香型窖泥分離出Streptomyces、Massilia、Nocardiopsis3 個屬，其中以Streptomyces屬占優。這與本實驗結果有差異，主要原因可能與分析手段不同有關。在環境微生物的檢測中，往往需將可培養和免培養技術結合，以獲得更詳盡的科學數據。本實驗和前人的研究互為補充，進一步揭示出窖泥蘊藏著豐富的放線菌資源，應當引起研究者足夠重視。其次，原因可能還與本實驗樣品為單糧窖泥有關。單糧和多糧釀造采用的原料與工藝不同，但這是否會對群落結構及多樣性造成影響有待證實。

本實驗發現1 到50年間放線菌群落結構變化較大，此后趨于穩定。這與已報道的窖泥菌群結構變化[10- 11]相似，表明窖泥微生物演替具有共性。羅惠波等[12]認為，窖泥細菌菌群相似性以同窖齡樣品最高。同部位樣品的相似性較高，演替更顯規律性，說明放線菌群落結構和演替具有自身特殊性。放線菌的生物總量隨窖泥老熟而遞增[1]。這與本實驗窖壁泥光強度總值(N) 變化一致。不同的是，窖底泥變化截然相反，這可能和放線菌的好氧特性有關。具體到某一種群，無論窖壁或窖底泥，N值變化均不明顯。由此可見，放線菌生物總量的變化主要受多樣性影響。

實驗檢測到的種屬中，Streptomyces屬為多數樣品共有。王濤等[2]的研究顯示，來源于釀造環境的Streptomyces屬放線菌可產生酯、酸、醛、酮和醇類等濃香型白酒的香味物質。他推測該種屬可能在釀造中扮演重要角色。Streptomyces屬在張超等[9]和本研究中均被檢出，說明其在窖泥中穩定存在，可能對濃香型白酒釀造具有普遍作用。此外，其余種屬作用尚無報道。優勢屬Atopobium和Olsenella的主要生境是人體，兩者因親緣關系較近常被合并研究[13- 15]。它們存在于窖泥中有其合理性，并可能對釀造生產起到積極作用。首先，其專性厭氧特性與釀造環境相適應，這可能是其在窖底泥的優勢度不斷提高，同時也是未被張超等[9]分離到的原因之一；其次，代謝產物如乳酸，乙酸和丁酸等[15- 17]與濃香型白酒香味物質密切相關；最后，一些菌種如A.parvulum、O.umbonata均具有硫化物分解能力[13, 15]，這可能起到預防窖泥老化板結的作用。另外，Corynebacterium屬主要來源于乳制品、蔬菜和土壤等生境[18]。岳元媛等[19]發現1573 窖底泥也有該種屬存在。本實驗顯示，該種屬在50a以上窖泥中均可檢出，并以在窖底泥的豐度較高。同時，某些菌種如C.tuberculostearicum可能為100a以上的高齡窖底泥特有。雖然其作用尚不清楚，但這提示是否可從菌群的特有性來衡量窖泥老熟程度？這也是值得深入研究的課題。

4 結語

本實驗采用DGGE 技術初步解析了濃香型白酒窖泥放線菌的菌落結構及其多樣性。結果表明，窖泥放線菌歸屬于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium4 個屬。不同窖齡窖泥放線菌群落結構和多樣性具有一定差異，但同部位窖泥的菌群演替顯示出一定規律性。此結果有助于人們進一步認識放線菌在濃香型白酒釀造中所扮演的角色，從中篩選一些功能菌種并加以利用可能對人工窖泥配方的優化改良大有裨益。

本實驗供試窖泥采自瀘州老窖不同年份窖池，釀造產品分別面向不同層次消費市場，樣品來源具有代表性。由于窖泥樣品，尤其是高齡窖泥的稀有性，在今后工作中，應加強樣品的收集，增加樣品的全面性，使研究結果具有更廣泛的適用性，以利于相關研究的深入發展。

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Analysis of actinobacteria community and diversity in the pit mud of chinese luzhou-flavour liquor

LIU Maoke1,*, TANG Yuming1, ZHAO Ke2, REN Daoqun1, YAO Wanchun1, TIAN Xinhui1

1BiotechlogyCenter,Rice&SorghumResearchInstitute,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Luzhou646100,China2CollegeofResourceandEnvironment,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang611130,China

In this study, the pit mud of Luzhou-flavour liquor which was used for 1, 50, 100 and 400 years were taken from a factory affiliated to the Luzhou Laojiao Group. Eight mixed samples were sampled from the wall and bottom layers of the pit mud in the cellars. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was employed to analyse actinobacteria community structure and diversity from the samples.For the analysis, 16S rRNA fragments about 400 bp amplified from DNA extracted from the eight mixed pit mud samples. Among all samples, ten stronger bands and few number of less intense bands were detected, only three stronger bands can be amplified from each sample, differences between the DGGE patterns of the different position of pit mud were also detected. On the whole, however, the community of the samples taken from the same position was comparatively similar, and a regular pattern was observed during the community succession. In the same cellar, except the sample used for about 1 year, the diversity index (H) of the wall-layer sample was much higher than the bottom -layer samples′, while the evenness index (EH) is opposite. In addition, with the increase of pit age, theHvalues of the wall-layer sample gradually increased from 1.74 to 2.28, and decreased from 2.07 to 1.73 in the bottom-layer sample. Meanwhile all samples showed a linear trend toward decrease in theEHvalues, and the variation ofEHvalues of the wall and the bottom layers were between 0.986 to 0.991 and 0.971 to 0.994, respectively. Moreover, the similarity coefficient (SC) between the bottom layer enhanced with the increasing pit age, ranging from 0.46 to 0.82, and theSCvalues of the bottom layer ranged from 0.31 to 0.62. The recovery of DGGE strip series showed the 16S rRNA gene sequence similarity between the ten stronger bands and the typical strains published in Genbank was 90% to 100%, and those sequences belonged to four genera (Olsenella,Atopobium,StreptomycesandCorynebacterium).The three stronger bands that can be amplified from each sample belonged toOlsenellaandAtopobium. With the increasing pit age, the dominant degree (di) of the three stronger bands in the wall-layer generally decreased, but increased in the bottom-layer. This result revealed the abundant diversity of actinobacteria in the pit mud of Chinese Luzhou-flavour liquor. The actinobacteria community structure and diversity were different among different samples, whereas the community succession is regular. To our knowledge, this was the first time the community and diversity of acinobacteria in pit mud were reported.

pit mud; actinobacteria; community; succession; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

四川省財政基因工程專項資金項目(2012QNJJ- 022); 四川省財政創新能力提升工程專項基金(2013- 018); 瀘州市科技計劃社會發展項目(2012-S- 30)

2013- 04- 10;

日期:2014- 04- 03

10.5846/stxb201304100664

*通訊作者Corresponding author.E-mail: liumaoke 0307@163.com

劉茂柯，唐玉明，趙珂，任道群，姚萬春，田新惠.濃香型白酒窖泥放線菌的群落結構及其多樣性.生態學報,2015,35(3):858- 864.

Liu M K, Tang Y M, Zhao K, Ren D Q, Yao W C, Tian X H.Analysis of actinobacteria community and diversity in the pit mud of chinese luzhou-flavour liquor.Acta Ecologica Sinica,2015,35(3):858- 864.