阿爾茨海默病轉基因動物模型的學習記憶能力改變及病理學觀察

董賢慧，謝紅林，白江濤，嚴 鵬，賀小平，柴錫慶，吳彥華，沈瑞紅

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與年齡相關的以進行性記憶和認知功能障礙為特征的神經變性疾病。特征性病理變化表現為膽堿能神經元功能障礙、神經元和突觸丟失、細胞外β-淀粉樣肽(Amyloidbeta，Aβ)聚集形成老年斑(sennepfaques，SPs)和細胞內高度磷酸化的tau 蛋白形成神經原纖維纏結(neuroribrillarytangles，NFTs)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性的APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠與C57BL/6J 小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司。單籠喂養于光照/黑暗為12/12的恒溫環境，自由攝食和飲水。

1.2 方法

1.2.1 采用Morris 水迷宮檢測各組小鼠的學習記憶能力 采用Morris 水迷宮對各組小鼠進行行為認知能力測試。Morris 水迷宮主要由圓形水池和自動錄像及分析系統組成。圓形水池直徑120 cm、高50 cm，平臺直徑為10 cm，在整個實驗中保持操作者位置及周圍環境的相對穩定。

1.2.1.1 定位航行試驗 歷時5 d，每日分上、下午兩個時段，固定時間為每日上午9:00～11:00，下午14:00～16:00 進行。兩個時段分別從4 個不同入水點將小鼠放入水中，入水時小鼠面向水池壁，記錄小鼠找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期。若小鼠入水后2 min 內未能找到平臺，則將其引導置于平臺上，并停留10 s，記錄逃避潛伏期為120 s。每次訓練時間間隔為60 s。

1.2.1.2 空間探索實驗 該實驗用于測量動物對平臺空間位置準確記憶，即記憶保持能力。水迷宮進行6 d 將平臺撤除，任選一個入水點將小鼠放入水中，游泳120 s，記錄120 s 內小鼠跨過原平臺的次數，即跨臺次數。

1.2.2 改良Bielschowsky 銀染法觀察小鼠腦內老年斑 小鼠水迷宮后，甲醛灌注處死后取腦，石蠟包埋，常規石蠟切片脫臘至水，20% AgNO3水溶液37 ℃孵育30 min，4%甲醛還原，滴加銀氨染液200 μl 室溫孵育10 min，3 %甲醛溶液浸泡，酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，于光鏡下觀察。

1.2.3 尼氏染色觀察 同上進行石蠟包埋、切片、脫蠟至水，置于預熱至60 ℃的2 %硫瑾染色30 min后，水洗，95%酒精分色，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮檢測各組小鼠的學習記憶能力情況 水迷宮定位航行實驗結果顯示，APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠的逃避潛伏期與C57 對照組小鼠相比明顯延長(P＜0.05)(見圖1A);空間探索實驗結果顯示，APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠與C57 對照組小鼠相比垮臺次數減少(P＜0.05)(見圖1B)。

圖1 Morris 水迷宮檢測各組小鼠學習記憶能力情況

2.2 改良Bielschowsky 銀染法觀察小鼠腦內老年斑 改良Bielschowsky 銀染法結果顯示:C57對照組小鼠大腦皮質組織未見明顯改變，神經原纖維排列整齊有序、稀疏(見圖2A)。模型組小鼠大腦皮質神經原纖維腫脹，密集成寬帶狀，深染，可見神經纖維纏結(NFT)，散在分布有老年斑(SP)(見圖2B，箭頭所指為老年斑)。

2.3 尼氏染色觀察小鼠腦內病理改變 尼氏染色結果顯示，C57 對照組小鼠海馬各區神經細胞排列密集、整齊，胞漿中尼氏體豐富，大腦皮質尼氏小體呈深藍色，細胞核淡藍色，背景略呈淺藍色(見圖3A);APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠神經元水腫，細胞數量減少，排列稀疏，細胞間隙增大，胞漿內尼氏體減少，分界不清，染成淡藍色(見圖3B)。

圖2 改良Bielschowsky 銀染法觀察小鼠腦內老年斑情況

圖3 尼氏染色法觀察小鼠腦組織病理學變化

3 討論

AD 是較為常見的老年人慢性退行性神經系統疾病，目前其病因及其發病機制還不是十分清楚，一定程度上制約了其治療藥物的篩選。

研究AD 有效治療藥物的主要障礙之一就是缺乏合適的AD 動物模型。建立合格的動物模型，可以在動物身上復制人類疾病模型，用于研究人類疾病的發病機制及治療和預防措施。有關AD 動物模型，人們已經設計了很多種，包括Aβ 模型［1］、膽堿能系統損傷模型［2］、tau 蛋白模型［3］、鋁模型［4］等，以上這些模型在一定程度上復制了AD 的部分特征性病理改變，但是仍然不能完全模型AD 的漸進性退行性改變，都不能算做理想的AD 動物模型。

AD 的發生是一個復雜的、多元的過程，其中遺傳因素是一個重要因素。研究發現，AD 的發病與1號、14 號、19 號及21 號染色體等密切相關［5］，其中包括APP 基因、Tau 蛋白基因［6］、早老蛋白(Presenilin，PS)基因［7］、UBQLN1(ubiquilin-1)蛋白基因［8］、載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)基因［9］、α2 巨球蛋白基因(α2M)［10］、組織蛋白酶D 基因(CTSD基因)、丁酰膽堿酯酶基因(BCHE 基因)、超氧化物岐化酶基因、脂蛋白受體相關蛋白基因(LRP 基因)、α1-抗糜蛋白酶基因、血管緊張素轉換酶基因(ACE 基因)、突觸核蛋白基因及二氫脂酰胺琥珀酰轉移酶基因以及其他許多不直接生成蛋白質的調節元素。除此以外，轉基因動物(transgenic animal)技術日趨成熟，該技術可以在活體上研究某一特定致病基因的作用，這為建立AD 轉基因動物模型提供了技術條件。

有關AD 轉基因動物模型，其種類很多，包括單轉基因動物模型，像PDAPP 小鼠［11］、Tg2576［12］、APP23［13］、PS 轉基因小鼠［14］、JNPL3［15］等;雙轉基因動物模型，像 APPswe/PS1M146L、APPSL/PS1M146L、APPSL/PS1kI、APP KM670/671NL/APP V717F［16］、APP/ApoE 等;還包括多重轉基因動物模型，如APP/PS1/tau［17，18］、Cdk5/P35/tau 等。而 目前應用最為廣泛的為APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠模型，該模型PS1 基因E9 缺失，不是滅活作用，促使其功能加強，是國際公認的AD 轉基因動物模型。

本實驗研究APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠模型行為學及病理學變化，Morris 水迷宮實驗結果顯示9月齡APPswe/PS1ΔE9小鼠定位航行實驗與空間探索實驗結果與同月齡C57 小鼠相比有明顯差異，說明9 月齡APPswe/PS1ΔE9小鼠出現明顯的記憶能力缺陷，這與本實驗中病理學方法，改良Bielschowsky 銀染法結果發現9 月齡APPswe/PS1ΔE9小鼠大腦皮質散在分布有老年斑和尼氏染色結果顯示的APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠神經元水腫，細胞數量減少，尼氏體減少的結果相一致。

轉基因動物模型是一種基于病因的動物模型，其有著特殊的遺傳學優勢，使得AD 轉基因動物模型堪稱為研究AD 發病機制及干預措施的理想動物模型。AD 轉基因動物模型的建立，有利于科研工作者深入研究AD 發病機制，并有利于進一步有針對性的研究AD 的有效治療藥物。

AD 動物模型研究的重點就是轉基因動物模型，但是AD 病理過程錯綜復雜，因此，AD 轉基因動物模型還有很大的發展空間。目前，研究發現與AD 發病有關的基因位點數量有限，還需發現新的位點，明確更多與AD 發病有關的基因位點，將有利于建立新的AD 轉基因動物模型。AD 多重轉基因模型日漸增多，技術逐漸完善，但是要完全攻克轉基因動物模型的技術困難仍有很長的路要走，如果在轉基因的基礎上，再加以中樞膽堿能損害、自身免疫損傷等其他致病因素，將建立更為接近人類AD 的動物模型。

AD 相關遺傳因素的新發現，將使得基因構建更加完善，AD 轉基因動物模型也將進一步接近AD的全部病理特征。采用交互繁殖策略來建立多重轉基因動物模型，或者進一步構建更為復雜的基因，將有助于同時表達多個AD 相關的致病基因。

本實驗觀察APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠的行為學及病理學改變，證明建立的APPswe/PS1ΔE9雙轉基因小鼠模型是較好的阿爾茨海默病小鼠轉基因動物模型，為阿爾茨海默病發病機制研究和藥物研發提供了有價值的動物模型。

綜上所述，未來繼續推出具備所有人AD 病理特征的理想的轉基因動物模型對于開發新的治療藥物，準確的檢驗治療方法和預測治療效果是至關重要的。

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