家族性帕金森病相關遺傳基因LRRK2 的差異性研究

姜立剛，李海平，王朝輝，孫博謙，李 威

家族性帕金森病是一種常染色體顯性遺傳疾病，約占帕金森病總量的5%～10%，主要的臨床特征為靜止性震顫、動作遲緩、肌肉僵直等［1］。據報道，該疾病的病發與多種基因遺傳特性存在相關性，LRRK2 基因(Leucine-rich Repeat Kinase 2)是其中一種能夠引起家族性帕金森病的關鍵基因［2］，在該基因上已經發現了多種突變位點［3，4］，其中p.G2019S突變型是歐洲人群較為常見的基因型，大約有5%～13%的帕金森患者攜帶該基因，而在亞洲人群則比較少見［5，6］;p.R1441G/C/H 基因型也是歐洲人群常見的基因型，其中p.R1441G 基因型主要發現于西班牙人群，在其他地區人群中極少出現，尚不清楚該基因型在亞洲人群的分布情況［7，8］;p.K616R基因型在漢族人群中首先被發現，尚未在其他種族人群中被檢出［9］，這些結果顯示，家族性帕金森病的LRRK2 基因的突變類型及頻率均有很大的區域性和種族差異性，因此，雖然目前對家族性帕金森病相關遺傳基因的差異性已經有了一定的研究，但是由于針對漢族人群的遺傳差異性研究還不多見，因此，對漢族人群家族性帕金森病的LRRK2基因的突變類型及頻率進行研究仍具有很大的意義。本文對來源于漢族人群的21 例家族性帕金森癥患者，其中包括1 個帕金森病家族的3 例家族性帕金森病患者的LRRK2 基因7 種突變類型進行Sanger 檢測，并分析其攜帶的基因突變型與其他種族人群的差異性。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料 全血基因組DNA 提取試劑盒購自德國Qiagen 公司;Taq DNA 聚合酶及dNTP 購自大連TAKARA 公司;瓊脂糖凝膠購自美國Sigma公司;LRRK2 基因目標擴增序列來源于NCBI 網站，引物設計參考文獻［10］，引物由上海英俊公司訂購;PCR 擴增儀器購自杭州朗基科技股份有限公司;凝膠成像儀器購自上海天能科技股份有限公司。

1.2 研究對象 于2013 年11 月～2015 年3月期間收集吉林省通化地區、吉林省白山地區漢族家族性帕金森病患者21 例，其中男性患者13 例，女性患者8 例，且已知有3 例家族性帕金森病為一個家族的兩代人。男性患者年齡為57.4±12.1 歲，患病年齡為52.4±11.3 歲，患病時間為6.13±5.42 y;女性患者年齡為59.7±13.2 歲，患病年齡為51.7±11.6 歲，患病時間為6.34±5.31 y。患者臨床癥狀包含靜止性震顫、動作遲緩及肌肉強直3 項指標中的2 項相則診斷為帕金森病，其中有些患者接受過多巴胺治療。所有病例研究均經患者本人同意，并經倫理委員會批準。

1.3 基因型檢測 分別抽取患者5 ml 外周血，采用全血提取試劑盒(Qiagen，德國)提取全血基因組DNA。采用文獻引物擴增LRRK2 基因上的p.K616R、p.R1441G、p.R1441C、p.Y1699C、p.G2019S、p.I2020T 及p.G2385R 7 種突變位點［10］。50 μl 反應擴增體系包括1×buffer、1 μmol/L 上游引物、1 μmol/L 下游引物、0.5 mM dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶，加入50 ng 基因組DNA 作為模板，擴增程序為:95 ℃2 min，95 ℃1 min，55 ℃20 s，72 ℃1 min，72 ℃10 min。擴增產物經電泳驗證后，由上海華大基因進行Sanger 測序。

1.4123I-IMP SPECT 顯像 采用碘代苯異丙胺單質子X 線斷層攝影術(123I-IMP SPECT)對來自一個家族的3 例帕金森病進行區域腦血流量檢測。

1.5 數據分析 采用Chromas 2.4 查看Sanger測序圖譜，統計每例樣本的基因分型，并分析每種基因突變型在漢族人群中分布頻率。

2 結果

2.1 基因突變型分布頻率分析 對Sanger 測序結果進行分析后，得到如表1 所示的LRRK2 基因上的7 種基因型頻率分布如表1 所示，21 例家族性帕金森病患者中，p.G2385R 突變型最多，達到23.8%;而p.R1441G 突變型有3 例，占總病例數的14.3%;p.K616R 突變型有2 例，占總病例數的4.76%;而其他突變型如p.G2019S、p.R1441C、p.Y1699C及p.I2020T 則未檢出，均為0%。結果顯示，p.G2019S 基因突變型在漢族人群中所占的比例較大，且根據突變型頻率分布，帕金森癥的基因型分布具有很顯著的家族性，如p.R1441G 突變型僅在一個家族中被檢出。

表1 7 種基因型頻率分布

2.2 家系圖譜分析 在對病例中3 個來自于一個家族的帕金森病患者進行后期的追蹤中發現，該家族除了收錄的3 例帕金森病例外在第一代中還有3 例已經患了該病的病例，但未在本研究內。該家族的帕金森病譜系及來源于該家族的3 例家族性帕金森病病例的Sanger 測序結果分別如圖1A 及圖1B 所示。如圖1A，該家族中1a、1c、1e、1h、2b、2d 共6 個成員患帕金森病，根據Sanger 測序結果(見圖1B)顯示，帕金森病患者1h、2b、2d 均存在p.R1441G(LRRK2 4321C＞G)，其健康的兄弟2c 作為正常對照組。

2.3 病例分析 采用碘代苯異丙胺的123I-IMP SPECT 成像技術對來自一個家族的3 例家族性帕金森病患者進行檢測，結果如圖2 所示，圖3A、圖3B及圖3C 分別對應2d、1h 及2b。結果顯示，患者2 d的123I-IMP SPECT 結果正常;患者1h 的123I-IMP SPECT 結果則顯示患者雙側額葉區血流量明顯下降;患者2b 的123I-IMP SPECT 結果則顯示患者右側基底節區血流量明顯下降。

圖1 一家族性帕金森病譜系及基因突變型分析

圖2 123I-IMP SPECT 成像分析

3 討論

LRRK2 基因位于12 號染色體上，包含有51 個外顯子，LRRK2 蛋白共包含2527 氨基酸殘基的多功能域蛋白分子，因此，LRRK2 蛋白在多種細胞信號通路中具有重要的作用［11］。在多種功能域中，位于ROC 羧基端上的GTPase 功能域較為重要，在生理條件下能夠水解GTP，而當LRRK2 基因發生突變后，表達的LRRK2 蛋白GTPase 將被抑制，因而影響機體細胞的正常生理功能，目前已經證實，該蛋白與帕金森病存在很重要的關系［12］。在LRRK2 蛋白的重要性逐漸被揭示的同時，LRRK2 基因的單核苷酸多樣性也逐漸被揭示，繼p.R1441G 和p.Y1699C 在歐洲地區的英格蘭人和巴斯克人兩種族人群中被檢出后，其他不同突變體也逐漸在世界不同地區和種族人群被檢出［13，14］，目前已經證實該基因是帕金森病常染色體顯性遺傳基因中突變頻率最高且最常見的致病基因。

本文以21 例家族性帕金森病患者為對象，對能夠引起家族性帕金森病的LRRK2 基因上的7 種已知突變類型通過擴增在測序進行分析研究，發現在21 例患者中，p.G2385R 突變型最多，達到23.8%;而p.R1441G 突變型有3 例，占總病例數的14.3%;p.K616R 突變型有2 例，占總病例數的4.76%;而其他突變型如p.G2019S、p.R1441C、p.Y1699C 及p.I2020T 則未檢出，均為0%。這一結果與其他地區的研究結果存在一定的差異性。根據以往的研究，家族性帕金森病突變基因LRRK2 基因的突變頻率在不同的區域和種族中具有很大的差異。p.G2019S突變型在世界范圍內多種族、多地區均很常見的引起家族性帕金森癥的基因突變型，但是該突變型在不同的地區也呈現很大的頻率差異［15］，在北非人群中分別頻率最高，達到35.7%，其中在突尼斯人中高達達到42%，而歐人人群中僅占4%，但是在西班牙人群中則達到18.7%，亞洲人群更低，分布頻率小于0.1%，這些結果與本研究結果基本相吻合。在亞洲人群中，p.G2385R 基因型是LRRK2 基因上一種較為常見的引起家族性帕金森病的突變類型，其中在中國漢族人群中該位點基因突變型是目前出現頻率最高的一種基因型，在中國臺灣人群中帕金森患者中有11.7%存在該基因位點的突變型，本文研究中該突變位點的頻率為8.39%，而在亞洲以外的其他地區還未見該位點的突變型被檢出。在目前的研究中，p.R1441G 突變類型主要出現在西班牙北部尤其是巴斯克人種群中，在亞洲人群中也偶有出現，但頻率較低，而本研究中發現了一個攜帶p.R1441G突變類型的家族，但在其他病例中未見有該基因位點突變，這說明LRRK2 的該基因突變類型也是一種世界范圍的突變位點。另外，p.K616R 基因突變類型是最新在中國人群中發現的一種LRRK2基因突變型［9］，在本研究的21 例家族性帕金森患者中也發現了2 例患者攜帶該類型的突變基因，這在一定程度上證實了中國人群中確實存在LRRK2 p.K616R這一基因突變類型。

根據先前的研究，攜帶有p.R1441G 突變類型的巴斯克人帕金森癥家族患病成員的病理特征包括對左旋多巴治療敏感、肌肉僵直、運動障礙等均與先天性帕金森癥很相似，另外，攜帶該基因的家族成員患病由早發的跡象(發病年齡小于50 歲)，而在本研究中也顯示家族性帕金森病患者2b 和2d 也存在早發的跡象。在123I-IMP SPECT 成像檢測中則顯示，攜帶有p.R1441G 突變帕金森病患者與先天性帕金森癥存在差異性，如患者1h 的123I-IMP SPECT 成像顯示了腦額葉血流灌注不足，而患者2b 的123I-IMP SPECT 成像則顯示腦基底神經節灌注不足，這些現象與與先天性帕金森癥存在差異［16］。針對攜帶有p.R1441G 突變帕金森病患者與先天性帕金森癥的更深層次的聯系還有待于進一步的研究。

4 小 結

本文通過對21 例家族性帕金森病患者包括3例來源于同一家族的患者的研究，采用Sanger 測序獲得每個患者LRRK2 基因上的7 種基因突變類型。在21 例患者樣本中，首次在中國人群中發現來自一個家族3 例攜帶p.R1441G 的帕金森患者，同時攜帶p.G2385R 突變基因型的患者最多，而北非地區患者攜帶比例達到35.7%的p.G2019S 突變基因型在中國人群中未發現該突變類型，中國人群中新發現的p.K616R 突變基因型在本研究的患者中占4.76%，而p.R1441C、p.Y1699C 及p.I2020T 則未檢出。與以往的研究對比顯示，家族性帕金森病攜帶的LRRK2 基因突變型及突變頻率均存在區域和種族的差異性。在對來自同一個家族、攜帶p.R1441G 突變基因型的3 例帕金森患者的研究中發現，其臨床特征與先天性帕金森病存在一定的差異，需要進一步的研究。

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