二咖啡酰奎寧酸對腦缺血后星形膠質細胞Porimin 指標的影響觀察

付學軍，黃巧英，黃 瑩，張 睿，褚曉凡

二咖啡?？鼘幩?dicaffeoylquinic acids，DCQ)是一類由奎寧酸(quinc acid)與數目不等的咖啡酸(caffeic acid)通過酯化反應縮合而成的酚酸類天然成分。二咖啡酰奎寧酸是臨床常用的治療缺血性腦血管病等疾病的藥物如燈盞細辛、脈絡寧等的主要成分，研究表明其與血清蛋白結合情況良好。目前通過化學方法能從中藥中提煉出二咖啡?？鼘幩釂误w。若能夠證明二咖啡?？鼘幩釂我怀煞种苿δX缺血治療有效，將具有極佳的臨床應用前景。本研究，在持續腦缺血大鼠模型的基礎上，應用1，5-二咖啡奎寧酸啡酸酯，將各組大鼠的存活率、固定大腦切片梗死面積、組織學改變以及promin 表達情況作為主要觀察指標，探討該藥物對持續性缺血后腦損傷、細胞免疫指標等方面的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 32 只雄性SD 大鼠(健康清潔級，體重250～300 g，鼠齡3～4 m，廣東省動物中心提供);3，5 二咖啡奎寧酸由深圳市生物谷醫藥研究院有限公司提供;動物分組:實驗動物隨機分為空白組(正常)6 只、對照組(生理鹽水組)、藥物組，對照組及藥物組又按照缺血時間(6 h 及24 h)分成2 個亞組。空白組、對照組每個亞組各6 只大鼠，藥物組各亞組7 只大鼠?？瞻捉M不做任何處理，對照組及藥物組均制成左大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。給藥方法:各組均在造模并縫合皮膚后即刻尾靜脈注射相應藥物;藥物組給予3，5-二咖啡奎寧酸(0.36mg/kg)［1］尾靜脈注射，對照組予生理鹽水。采用盲法給藥，給藥由專人負責，造模者回避。分別于MCAO后6 h、24 h 進行行為學檢測及神經功能評分;然后取腦作組織學檢查及免疫熒光檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 MCAO 模型制備 MCAO 模型制備采用褚曉凡教授在Zea Longa 基礎上改良的頸內動脈線栓加環扎法［2］。術前動物禁食12 h，但可以自由飲水。10%水合氯醛0.3 ml/100 g 腹腔麻醉。通過使用反饋控制的熱墊保持肛溫在37.5 ℃。

1.2.2 神經功能評分 采用Menzies 等［3］描述的方法并做了一些改良進行神經功能評分:0 分:無明顯改變;1 分:向后拖拽尾巴時對側上肢彎曲;2分:向后拖拽尾巴時對側前肢抓力減弱;3 分:可自發向各方向移動，但向后拖拽尾巴時向對側轉圈;4分:自發向對側轉圈;5 分:死亡。

1.2.3 組織學檢查 MCAO 后6 h 及24 h，動物被再麻醉，經心臟灌注4%多聚甲醛(溶于0.1 mol/L PBS 溶液)固定。取腦，放入4%多聚甲醛中4 ℃浸泡6 h，然后移到4 ℃的25%蔗糖中3～4 d直至沉底。用25%蔗糖和O.C.T 的混合物(2∶1)包埋腦，棄掉大腦前部分2 mm，而后恒冷箱行冠狀連續切片，片厚20 μm，每2 mm 間隔取一張貼于玻片上，每張玻片共有5 片腦組織，分別行Cresyl Violet 染色及HE 染色(按照Cresyl Violet 及HE 染色試劑盒方法進行)。HE 染色用于觀察細胞形態，確定缺血半暗帶區。Cresyl Violet 染色用于評定造模是否成功并通過Image J 軟件測量腦梗死體積。為避免腦水腫的影響，采用如下計算方法:梗死體積=對側半球體積-同側半球非梗死區體積，腦腫脹比率=梗死側半球體積/對側半球體積。

1.2.4 免疫熒光檢測 從-80 ℃冰箱中取出切片，回溫后，切成厚度為20μm 腦片;洗片后［0.1 mol/LPBS(pH=4)洗3 次，每次5 min］以10%胎羊血清、0.3% TritonX-100、0.1 mol/L PBS 封閉液，室溫搖床封閉60 min;應用抗體稀釋液(含0.1%TritonX-100、0.1 mol/L PBS)稀釋一抗(Porimin 及GFAP)，每張切片200 μl，4 ℃過夜。沖洗后應用抗體稀釋液稀釋熒光第二抗體。室溫孵育3 h。此整個熒光抗體稀釋及添加過程需注意避光。沖洗后加入DAPI 染色液室溫避光作用2 min;用免疫熒光洗滌液在室溫避光漂洗3 次，每次5 min;封片后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。分別觀察5個視野的平均面積內Porimin 與GFAP、DAPI 陽性細胞并計數。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0 版統計軟件包進行統計，計量資料采用±s 表示，各組間均數比較采用t 檢驗及方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物存活情況 實驗共選用實驗動物32 只，成活30 只。對照組(6 h)6 只和藥物組6 h 組7 只均成活。對照組及藥物組24 h 組各有1 只大鼠死亡;兩組死亡大鼠解剖后均可見顱底血凝塊同時見腦組織腫脹明顯。進入統計學分析30 只。

2.2 行為學分析 空白組實驗動物神經功能評分為0 分，對照組和藥物組動物在缺血6 h 評分中位數4 分，四分位間距(QR)為0.75，缺血24 h 組評分中位數為3 分，四分位間距(QR)為1.5 分，建模成功。

2.3 腦梗死體積及腦腫脹比率 空白組Cresyl Violet 染色未見梗死灶。對照組和藥物組可見左側大腦中動脈區域明顯梗死灶，提示造模成功。且在兩組中，缺血6 h 腦梗死體積顯著小于缺血24h腦梗死體積。相對于藥物組，對照組各亞組大腦半球腦腫脹比率(6 h 與24 h)顯著大于藥物組(均P＜0.01);比較藥物組各亞組大腦半球腦腫脹比率發現，缺血6h 組腦腫脹比率小于缺血24 h 組，差異有統計學意義。

2.4 形態學分析 空白組:腦切片HE 染色未見缺血病灶，細胞形態學與正常對照組比較無明顯變化。對照組及藥物組:兩組腦切片HE 染色均可見明顯缺血灶，非缺血側未見細胞形態改變，缺血中心區大體觀察染色偏淡，組織疏松，與正常組織存在差異，兩組的缺血時間越長，變化越為明顯。對照組缺血6 h 中心區細胞疏松，星形膠質細胞腫脹明顯、核仁偏移、核變形、染色變淺;半暗帶區細胞水腫，散在腫脹的星形膠質細胞，部分星形膠質細胞呈空泡變。藥物組缺血6 h 中心區細胞輕度疏松，星形膠質細胞腫脹、核仁變形、核略深染;半暗帶區6 h 星形膠質細胞腫脹，細胞周圍間隙略寬。對照組缺血24 h 中心區可見大空泡樣變化細胞，細胞正常結構消失，星形膠質細胞難以辨認;缺血半暗帶區細胞水腫明顯，可見有腫脹的星形膠質細胞。藥物組缺血24 h 中心區也可見大空泡樣變化細胞，細胞正常結構亦消失;缺血24 h 半暗帶區細胞水腫明顯，可見有腫脹的星形膠質細胞。

2.5 免疫熒光檢測 空白組可見形態正常的GFAP 表達陽性細胞，未見明確Porimin 表達陽性的細胞;對照組MCAO 后6 h，大腦中動脈栓塞中心區可見大量破碎的GFAP 陽性細胞，半暗帶區偶可見GFAP 陽性細胞突觸消失，胞體明顯腫脹，偶見Porimin 與GFAP、DAPI 三標陽性細胞;MCAO 后24 h，中心區細胞大多破碎，半暗帶區可見較多Porimin 與GFAP、DAPI 三標陽性腫脹細胞。藥物組MCAO 后6 h，大腦中動脈栓塞中心區可見同對照組，半暗帶區亦偶可見腫脹的GFAP 陽性細胞，偶見Porimin 與GFAP、DAPI 三標陽性細胞;MCAO 后24h，中心區未見正常細胞結構，半暗帶區亦可見GFAP、DAPI 三標陽性腫脹細胞。

比較對照組與藥物組MCAO 后24 h 半暗帶區Porimin 與GFAP、DAPI 三標陽性細胞數目發現，藥物組Porimin 與GFAP、DAPI 三標陽性細胞數目顯著低于對照組，兩者間差異有統計學意義(P=0.01)。

圖1 MCAO 后半暗帶區Porimin 與GFAP 的表達

圖2 MCAO 后24h 藥物組與對照組半暗帶區Porimin 與GFAP、DAPI 三標陽性細胞數目比較

3 討論

腦卒中是人類的常見病和多發病，其以較高的發病率、致殘率和病死率，嚴重威脅著人類健康。腦卒中患者不同程度的喪失各種活動功能，對其生活、工作能力及精神心理狀態都有極大影響。據統計，我國目前急性腦血管病發病總人數超過百萬例，而其中急性缺血性腦卒中(腦梗死)約占全部腦卒中的60%～80%［4］。急性缺血性腦卒中由中心壞死區及其周圍的缺血半暗帶區組成，腦梗死治療的最主要靶點就是搶救缺血半暗帶。研究表明，缺血半暗帶區與星形膠質細胞關系緊密，星形膠質細胞連接血管內皮細胞和血管周圍的神經元，共同組成“神經血管單元”，在腦缺血的早期起著腦保護的關鍵作用［5］。

星形膠質細胞廣泛存在于大腦灰質及白質中，對神經細胞起著支持隔離、營養代謝、信號傳遞等重要作用。本研究中HE 染色結果顯示，在對照組和藥物組中，缺血24h 半暗帶區星形膠質細胞的腫脹與缺血6h 相比均有差異，這與我們前期研究中得出就結論相一致，就是腦缺血時間越長，半暗帶區星形膠質細胞損傷越重。由于星形膠質細胞在神經血管單元中的位置，使其成為遭受缺血打擊后直接受損的腦細胞［5］。因此，在研究缺血性腦血管病的治療措施的過程中，應提高對保護和搶救星形膠質細胞的認識。

在前期的研究中［6，7］，我們通過形態學的觀察和免疫學的驗證提出了星形膠質細胞在腦缺血過程中存在脹亡的死亡形式。脹亡(oncosis)主要表現為細胞受損后體積擴大，膜通透性增加、完整性破壞，DNA 裂解成為非特異性片段，最后細胞溶解，胞質漏出并伴有周圍組織炎癥反應。研究表明星形膠質細胞脹亡這一轉歸與細胞膜上Porimin 受體激活相關［8，9］。Porimin 是一種高度糖基化的跨膜受體蛋白，包含189 個氨基酸，屬于細胞膜相關粘蛋白家族。其可在缺氧、底物缺乏、ATP 進行性減少等情況下被激活，并迅速與其配體抗-Porimin mAb 結合，造成各種膜性結構的損傷，譬如胞膜起泡，胞膜通透性增加，孔道形成等，從而啟動細胞脹亡。該蛋白特異表達在將要發生脹亡的細胞表面。Porimin 與缺血損傷的發生密切相關，目前對于心肌細胞、腎細胞缺血后脹亡發生與Porimin 表達的相關研究較多［10，11］，但在神經系統方面的研究相對較少。本實驗結果中，對照組在MCAO 后6h 組DAPI、GFAP 與Porimin 陽性表達細胞不多，而24h 后半暗帶區存在著數量尚可的DAPI、GFAP 和Porimin 三重標記的陽性細胞，這提示星形膠質細胞在半暗帶區存在脹亡。隨著缺血時間延長，三標陽性細胞的增加可能與缺血后細胞的損傷程度相關。針對這一特性，本研究選取Porimin 作為星形膠質細胞是否得到有效保護的指標，以1，5-二咖啡奎寧酸啡酸為保護劑做一觀察。

二咖啡?？鼘幩?dicaffeoylquinic acids，DCQ)是一類由奎寧酸(quinc acid)與數目不等的咖啡酸(caffeic acid)通過酯化反應縮合而成的酚酸類天然成分?？Х人狨ナ菬舯K花等植物的主要成分。目前已從燈盞花提煉出單體1，5 二咖啡酰氧基奎寧酸。二咖啡?？鼘幩嶙鳛橐环N來源于天然植物的中藥有效活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗纖維化、抗血小板活性、抗炎癥反應、降血脂、血糖等多種藥理作用［12～15］，具有極佳的臨床應用前景。萃取、分離純化技術的發展，更重要的是化學合成二咖啡酰奎寧酸技術的出現使得獲得大量純品成為可能。本研究中，藥物組在MCAO 后24 h 半暗帶區DAPI、GFAP與Porimin 陽性表達細胞明顯少于對照組在MCAO后24 h 半暗帶區的數量，表明二咖啡?？鼘幩峥蓽p少半暗帶區星形膠質細胞脹亡的發生，提示二咖啡奎寧酸對腦缺血半暗帶區星形膠質細胞起到一定保護作用。二咖啡奎寧酸對腦缺血半暗帶區膠質細胞保護的可能機制是通過提高GSH(glutathione，細胞谷胱甘肽)合成、減少ROS(reactive oxygen species，活性氧族)，從而保護缺血導致的星形膠質細胞損傷［16］。目前認為缺血性損傷后首先出現的病理生理變化即包括了ROS 生成過多，而且ROS 生成量與缺血損傷導致的星形膠質細胞功能障礙和遲發性死亡顯著相關［17，18］。GSH 是細胞抗氧化防御系統的重要成分之一，它既能直接與ROS 結合發揮抗氧化效應，也能作為多種過氧化物酶的底物參與抗氧化［19～21］。二咖啡奎寧酸通過提高GSH 合成、減少ROS，改善氧化應激損傷，起到保護腦缺血半暗帶區膠質細胞的作用。

通過本研究，我們認識到隨著腦缺血時間的延長，半暗帶區星形膠質細胞損傷逐漸加重，在二咖啡?？鼘幩嶙饔孟?，與星形細胞脹亡相關的porimin 指標有顯著意義的下降，表明二咖啡?？鼘幩釋δX缺血中星形膠質細胞的保護可能起一定積極作用。

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