重組pIRES-AD7c-NTP 質粒的構建表達及其對PC12 細胞凋亡的影響

白春艷，孫宏俠，胡軼虹，劉 敏，周 艷，李宗樹，張明明，王 凱

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)表現為漸進性加重的神經系統退行性改變，嚴重威脅著老年人的生活［1］。阿爾茨海默病相關神經絲蛋白(alzheimer associated neuronal thread protein，AD7c-NTP)是分子量為41 kD 的跨膜磷蛋白，在神經元胞體中表達，在AD 患者腦內選擇性升高［2］，與神經炎的萌發以及細胞的死亡有關［3］，因此在早期或相對嚴重的AD 患者腦脊液中可檢測到AD7c-NTP 的增高，而且腦脊液中AD7c-NTP 的水平與癡呆的嚴重程度相關。本研究旨在構建重組pIRES-AD7c-NTP質粒并表達在PC12 細胞內，觀察其對神經細胞凋亡的影響，為進一步探究AD7c-NTP 在AD 發病中起到的作用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞株與試劑 細胞株PC12 購自中國科學院上海細胞庫，引物及AD7c-NTP 全基因由上海生工生物工程技術公司合成，Taq 酶、限制性內切酶由日本TaKaRa 公司提供，質粒提取試劑盒由美國Promega 公司提供，pIRES-EGFP 質粒由Clontech公司提供，脂質體2000 由美國Invitrogen 公司提供，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 購自北京中山生物技術公司，兔抗人AD7c-NTP 抗體購自首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，RT-PCR 試劑盒由日本TaKaRa 公司提供。

1.2 方法

1.2.1 質粒pUC-AD7c-NTP 的擴增 AD7c-NTP 蛋白全基因委托上海生工生物工程技術公司合成，共1140bp。合成后的基因連接于克隆載體pUC。

1.2.2 重組表達載體pIRES-AD7c-NTP 的構建及制備 分別取含有目的基因AD7c-NTP 的重組質粒pUC-AD7c-NTP 和含報告基因EGFP 的表達載體pIRES-EGFP，以NheI/BamHI 進行雙酶消化，酶切產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用Genefinder 染色，在可見光透射儀下用手術刀片切下所需的條帶，按DNA 快速純化/回收試劑盒說明書進行回收。取一份凍存的感受態細胞冰上融化，加入上述連接產物，輕輕混勻進行轉化，轉化后DNA 測序。質粒定量后，-20℃保存，供轉染使用。

1.2.3 PC12 細胞的培養及轉染 PC12 細胞為貼壁細胞，培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，置于5%的CO2、37℃恒溫孵箱中，2～3 d傳代1 次。細胞轉染前24 h，用含10%胎牛血清的無抗生素培養液懸浮，接種在細胞培養板中，密度為5×105/ml。5%CO2，37℃培養18～24 h，使細胞融合達50%～80%。0.5 μl 脂質體2000 和0.2 μg 質粒分別稀釋于25 μl 不含血清和抗生素的培養液中，輕輕混勻，室溫靜置5 min。質粒稀釋液中加入上述25μl 脂質體2000 稀釋液，輕柔混勻，室溫孵育20 min。將50 μl 脂質體2000/質粒混合物滴加到96 孔培養板中，輕微搖晃，使培養液混勻。5%CO2、37 ℃培養箱培養。轉染4h 后細胞換液，除去脂質體，5%CO2、37 ℃培養箱繼續培養。

1.2.4 脂質體2000 介導細胞轉染最佳質粒/脂質體比值的確定 取對數生長期細胞，消化后以5×105/ml 的密度接種于96 孔培養板中。37 ℃，5%CO2培養24 h，使細胞融合達50%～80%。棄去細胞培養液，用無血清培養液洗滌細胞1 次，備轉染。分別按照一定含量配制脂質體2000/質粒混合物進行轉染。

1.2.5 流式細胞技術檢測細胞凋亡 PI 用氬離子激發熒光，產生紅色熒光，激發光波波長為488 nm，發射光波波長大于630 nm，可分析前散射光對側散射光的散點圖及PI 熒光的直方圖。混勻后上流式細胞儀做單參數分析。

1.2.6 RT-PCR 檢測bcl-2 及bax mRNA 表達變化 在PCR 儀上進行循環擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin 作為內參照，觀察各轉染組bax 及bcl-2 mRNA 表達變化。

2 結果

2.1 重組表達載體pIRES-AD7c-NTP 的構建

含有目的基因AD7c-NTP 的重組質粒pUC-AD7c-NTP 經NheI/BamHI 消化后，重組到載體pIRES-EGFP 相應的內切酶部位，常規轉化、篩選。NheI/Bam-HI 內切酶鑒定可見1100bp 左右片段，與預測片段長度相符。

2.2 PC12 細胞的轉染 分別按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶5 等不同比例(w/v)配制質粒/脂質體2000 混合物，對PC12 細胞進行轉染。載體構建時選擇了綠色熒光蛋白EGFP 作為報告基因，轉染24 h后，根據熒光顯微鏡下觀察到的基因瞬時表達，來確定最佳質粒/脂質體比值。結果顯示，PC12 細胞均在質粒/脂質體2000=1∶2～3 時轉染效率最佳(見圖1、圖2)。

2.3 RT-PCR 檢測凋亡相關蛋白mRNA 表達變化 分別提取未轉染細胞、轉染pIRES-EGFP 空白質粒的細胞及pIRES-AD7c-NTP 重組質粒轉染細胞的總RNA，以其為模板，RT-PCR 擴增bax、bcl-2及β-actin 基因。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小，并根據目的基因與內參β-actin 比值確定不同處理組細胞蛋白表達的變化(見圖3)。

2.3.1 bcl-2 含量變化 RT-PCR 結果顯示(見圖4、圖5)，pIRES-AD7c-NTP 重組質粒轉染組細胞bcl-2 表達(bcl-2/β-actin 灰度比為0.36)低于空質粒轉染組和對照組(bcl-2/β-actin 灰度比分別為0.85和0.95)，空質粒轉染組和對照組無顯著差異。

2.3.2 bax 含量變化 RT-PCR 結果顯示(見圖6、圖7)，pIRES-AD7c-NTP 重組質粒轉染組細胞bax 表達(bax/β-actin 灰度比為0.90)高于空質粒轉染組和對照組(bax/β-actin 灰度比分別為0.56和0.38)，空質粒轉染組和對照組差異不顯著。

圖1 單純脂質體轉染PC12 細胞(100×)

圖2 質粒/脂質體2000(1∶2)轉染PC12 細胞(100×)

圖3 PC12 細胞β-actin 電泳圖

圖4 PC12 細胞bcl-2 電泳圖

圖5 各轉染組細胞bcl-2 表達變化

圖6 PC12 細胞bax 電泳圖

圖7 各轉染組細胞bax 表達變化

3 討論

目前AD 的病因及其病理機制仍未明確，存在多種學說和假設，包括氧化應激和線粒體缺陷學說、Aβ 學說、膽堿能學說、基因學說、晚期糖基化終產物的諸多學說，國內外學者以此為依據形成了不同的診斷策略。在眾多學說中，氧化應激和線粒體缺陷學說占據著重要的地位［4］。因此，從線粒體缺陷和氧化應激角度研究AD 的發病機制，將為AD 的診斷和治療提供新的思路，也是抗AD 藥物研究的重要靶點。

目前，主要用于AD 氧化應激和線粒體缺陷研究的是Aβ25-35，經Aβ25-35 處理過的體外細胞可發生凋亡。1997 年，de laMonte 等用篩選人腦的cDNA 文庫，分離出AD7c-NTP，將該基因轉染至SHSy5y 內，被轉染的神經細胞過度表達，導致細胞的死亡和神經炎的發生。體外實驗表明，胰島素刺激SH-Sy5y 和PNET2 細胞會引起內源性AD7c-NTP 表達的增加和磷酸化反應增強［5］。另有學者發現，在AD7c-NTP 轉染的細胞中，受損的胰島素/IGF-1 信號通路可能介導了神經元的死亡，而且中樞神經元如果含有大量胰島素或IGF-1 受體，可能對AD7c-NTP 引起的損害效應尤其易感［6］。人類組織學研究也揭示，AD7c-NTP 在AD 腦顳葉和額葉的表達水平比對照組高，并且通過原位雜交和免疫組化染色發現，在組織學尚完整的變性神經元中出現AD7c-NTP 表達的增加［5］。所以AD7c-NTP 不僅是AD 神經元變性的一種標記分子，它在AD 發病機制中也發揮著重要作用［7～9］。

PC12 細胞已被廣泛應用于神經細胞分化、受體、離子通道、遞質分泌以及神經毒性的研究中，作為一種理想的神經系統體外模型［10］，PC12 細胞也被應用于AD、PD 等多種神經系統疾病的研究中。PC12 細胞有兩種形式:經神經生長因子(NGF)處理過的分化的PC12 細胞和未分化的PC12 細胞，兩者在形態、功能上均有一定差別。

本研究旨在構建重組pIRES-AD7c-NTP 質粒并表達在PC12 細胞內，觀察其對神經細胞的作用。含有目的基因AD7c-NTP 的重組質粒pUC-AD7c-NTP 經NheI/BamHI 消化后，重組到載體pIRES-EGFP 相應的內切酶部位轉化并篩選。NheI/BamHI 內切酶鑒定可見1100 bp 左右片段，與預測片段長度相，且DNA 測序結果與已知序列完全一致。然后對PC12 細胞進行轉染，轉染24h 根據熒光顯微鏡下觀察到的基因瞬時表達，來確定最佳質粒/脂質體比值。PC12 細胞在質粒/脂質體2000=1∶2～3 時轉染效率最佳。PC12 細胞轉染后48～72h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，結果顯示:RT-PCR 檢測凋亡相關蛋白mRNA 表達變化，bcl-2 含量結果顯示，pIRES-AD7c-NTP 重組質粒轉染組細胞bcl-2 表達低于空質粒轉染組和對照組;pIRES-AD7c-NTP 重組質粒轉染組細胞bax 表達高于空質粒轉染組和對照組。

綜上所述，AD7c-NTP 的過度表達可導致細胞凋亡及氧化損傷，關于氧自由基與AD7c-NTP 的關系，以及AD7c-NTP 功能的研究目前尚不多見，它究竟是突變基因表達的產物，還是蛋白質轉運和加工過程異常累積的結果，它在腦的正常功能中占據什么樣的地位，在AD 病理改變中發揮什么樣的作用以及導致細胞凋亡的原因，有待于進一步研究。

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［5］Levy S，McConville M，Lazaro GA，et al.Competitive ELISA studies of neural thread protein in urine in Alzheimer’s disease［J］.J Clin Lab Anal，2007，21:24-33.

［6］de la Monte SM，Wands JR.Alzheimer-associated neuronal thread protein mediated cell death is linked to impaired insulin signaling［J］.J Alzheimers Dis，2004，6:231-242.

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