促紅細胞生成素對大鼠腦缺血再灌注后claudin-5 和TNF-α 表達的影響

劉 坤，姚 陽，商麗宏，徐 暢，薛一雪

缺血性腦血管病以其高發病率和高死亡率嚴重危害著人們的健康。迅速溶栓進行再灌注是治療的關鍵。但快速溶栓會引起腦組織繼發性損害，主要原因是血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性遭到破壞［1］。利用缺血再灌注動物模型研究發現，促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)具有神經保護作用，可以減小腦梗死體積、降低BBB 通透性、減輕腦水腫程度［2］。目前，關于EPO 對缺血再灌注后BBB的作用機制還不清楚。緊密連接(tight junction，TJ)是維持BBB 完整性的重要結構和功能基礎［3］。claudin-5 是構成腦微血管內皮細胞TJ 的主要黏附分子，是TJ 形成的充要條件［4］。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是腦缺血再灌注損傷產生過程中的主要炎性因子，對TJ 蛋白claudin-5 的表達具有調節作用。

本研究利用腦缺血再灌注大鼠模型，腹腔注射EPO 進行預處理，觀察缺血側腦組織BBB 通透性的變化，腦微血管內皮細胞TJ 狀態及TJ 蛋白claudin-5 表達和TNF-α 含量的變化等，進一步探討EPO 對腦缺血再灌注后BBB 通透性的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物與分組 健康成年SD 大鼠125 只，雌雄不限，體重250～300 g，沈陽醫學院實驗動物中心提供。根據Jiao H 等［5］研究結果，BBB通透性在腦缺血再灌注后3 h 和72 h 最高，呈雙峰變化特點，動物隨機分為假手術組、生理鹽水再灌注3 h 組、生理鹽水再灌注72 h 組、EPO 再灌注3 h組、EPO 再灌注72 h 組，每組大鼠20 只。生理鹽水再灌注組于缺血同時腹腔注射生理鹽水2 ml，EPO再灌注組于缺血同時腹腔注射重組人 EPO 5000 U/kg溶于2 ml 生理鹽水中。

1.1.2 藥品與試劑 重組人EPO(Sigma 公司)，伊文思蘭(Evans blue，EB)(美國Fluka 公司)，claudin-5 抗體(Sigma 公司)，PV 超敏試劑盒(邁新生物技術有限公司)，濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(邁新生物技術有限公司)，TNF-α ELISA 試劑盒(Imgenex 公司)。

1.2 方 法

1.2.1 大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制備 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)，麻醉后，常規消毒，取頸正中切口，暴露右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)。于ECA和CCA 分叉處結扎ECA，用直徑為0.26 mm 尼龍線經CCA 進入ICA 約18～20 mm，遇輕微阻力時則為阻斷MCA 入口，造成局灶性腦缺血，2 h 后拔出尼龍線進行再灌注。假手術組所用栓線插入ICA深度＜10 mm。

1.2.2 激光多普勒血流儀檢測腦血流 將麻醉大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，正中矢狀切開頭頂皮膚，于冠狀縫后1 mm 和矢狀縫右5 mm 交點處鉆一小孔至硬腦膜，直徑約2 mm，此區域為缺血核心區域。將激光多普勒血流儀探頭置于孔內，測量大鼠大腦中動脈血流變化。記錄正常狀態下腦血流基礎值和缺血2 h 內血流變化。要求MCAO 后腦流量迅速下降到基礎值30%以下，不符合此標準動物去除，并隨機補充。

1.2.3 BBB 通透性的測定 大鼠經股靜脈2 ml/kg體重注入2%EB，2 h 后經左心室灌注生理鹽水至流出清亮液體，取腦，1 ml/100 mg 腦組織中加人甲酰胺溶液，60 ℃水浴中(避光)抽提24 h，酶標儀于620 nm 波長測光密度值，作出標準曲線，從標準曲線上算出腦組織中EB 含量(μg/g 腦重量)。

1.2.4 透射電鏡觀察TJ 麻醉大鼠4%多聚甲醛灌流固定，取缺血區腦組織額頂葉皮質1 mm3用2.5%戊二醛浸泡固定，2%四氧化鋨后固定，梯度酒精脫水，環氧樹脂618 包埋，超薄切片經醋酸鈾、枸椽酸鉛雙重染色后，在80 KV 條件下用JEM-1200EX 型透射電鏡觀察。

1.2.5 免疫組織化學法檢測TJ 蛋白claudin-5分布和表達水平變化 麻醉大鼠4%多聚甲醛灌流固定，斷頭，取額頂葉腦組織，30%蔗糖脫水，OTC包埋，冰凍切片機冠狀切片(厚10 μm)。一抗為山羊抗大鼠多克隆抗體，1∶200 稀釋，采用免疫組織化學SP 法，按試劑盒說明操作，DAB 顯色。結果用MoticImages Advanced 3.2 圖像分析系統采集照片，進行定量分析。

1.2.6 ELISA 法檢測TNF-α 含量 取0.05 g缺血腦組織、用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)在4 ℃條件下勻漿，再離心20 min，轉速1200 rpm，取上清液，根據試劑盒提供的步驟操作，測TNF-α 蛋白濃度。

2 結果

2.1 BBB 通透性的變化 EB 滲透性實驗評估BBB 通透性改變。假手術組大鼠腦組織未見藍染，再灌注各組大鼠大腦缺血區均可見不同程度藍染。結果顯示，再灌注3 h 和72 h 時，缺血側腦組織EB 含量與假手術組相比均顯著升高(P＜0.01);與再灌注同時間點生理鹽水組相比，EPO 預處理組大鼠缺血側腦組織EB 含量顯著降低(P＜0.01)(見表1)。

2.2 腦微血管內皮細胞間TJ 的變化 通過透射電鏡觀察到，假手術組大鼠腦組織微血管內皮細胞間TJ 結構完整，呈現出一系列電子的致密帶，而缺血再灌注后生理鹽水組大鼠腦組織TJ 呈現出清晰的可以識別的細胞間裂隙，EPO 預處理后基本恢復了TJ結構的完整性，再次呈現TJ 致密帶，提示EPO 預處理能夠改變BBB 的TJ 開放狀態(見圖1)。

2.3 免疫組織化學法檢測claudin-5 表達的變化 claudin-5 主要表達在微血管內皮細胞。在假手術組腦組織中，claudin-5 沿腦微血管持續表達，呈連續分布狀態。與假手術組相比，再灌注3 h 和72 h各組的缺血區腦組織中claudin-5 表達顯著降低(P＜0.01);EPO 預處理組大鼠缺血區腦組織中claudin-5 表達與再灌注同時間點生理鹽水組相比顯著增加(P＜0.01)(見表2、圖2)。

2.4 ELISA 法檢測TNF-α 含量變化 與假手術組相比，缺血再灌注3 h、72 h，缺血區腦組織TNF-α 蛋白濃度顯著升高(P＜0.01);EPO 預處理組與再灌注同時間點生理鹽水組相比，TNF-α 蛋白表達水平顯著降低(P＜0.01)(見表3)。

表1 實驗各組腦組織EB 含量的比較(±s)

表1 實驗各組腦組織EB 含量的比較(±s)

與假手術組比較* P＜0.01;與同時間點生理鹽水組比較#P＜0.01

表2 實驗各組腦組織claudin-5 表達平均光密度比較(±s)

表2 實驗各組腦組織claudin-5 表達平均光密度比較(±s)

與假手術組比較* P＜0.01;與同時間點生理鹽水組比較#P＜0.01

表3 實驗各組腦組織TNF-α 濃度的比較(±s)

表3 實驗各組腦組織TNF-α 濃度的比較(±s)

與假手術組比較* P＜0.01;與同時間點生理鹽水組比較#P＜0.01

3 討論

EPO 是一種造血細胞因子，主要用于治療多種原因所致的貧血，如腎衰、腫瘤化療等［6］。近年來研究發現，EPO 具有神經保護作用。EPO 預處理能夠減小缺血再灌注后腦梗死體積，降低BBB 通透性［2］，這與我們的研究結果一致。BBB 主要由腦微血管內皮細胞以及周圍的星形膠質細胞、周細胞、基底膜等成分組成，其中相鄰內皮細胞間的TJ 是保持BBB 完整性的重要功能單位，是決定BBB 通透性的主要因素［7］。腦缺血再灌注時，TJ 完整性破壞，經細胞旁途徑轉運入腦的物質增加，造成腦損傷［8］。本研究通過透射電鏡觀察發現，腦缺血再灌注3 h和72 h 時，腦微血管內皮細胞間TJ 明顯開放，EPO預處理能誘導TJ 關閉。TJ 由一組分子蛋白元件所構成，如:claudins、occludin 等，其中claudin-5 是腦微血管內皮細胞TJ 的特異性蛋白。通過體外培養大鼠腦毛細血管內皮細胞發現，claudin-5 的外源性表達可誘導BBB 的形成［9］。claudin-5 是TJ 形成的充要條件。

本研究結果顯示，腦缺血再灌注3 h 和72 h 時，缺血腦組織中claudin-5 mRNA 和蛋白表達均顯著減少，EPO 預處理能夠顯著上調claudin-5 mRNA 和蛋白表達水平。TNF-α 是重要的炎性介質，在中樞神經系統中，主要由小膠質細胞和星形膠質細胞等分泌。腦缺血再灌注會誘導TNF-α 大量產生。研究表明，TNF-α 對TJ 蛋白claudin-5 的表達具有調節作用。Aveleira 等［10］研究發現，TNF-α 能夠降低claudin-5 的mRNA 表達水平，使視網膜內皮細胞的通透性增加。TNF-α 還能上調基質金屬蛋白酶-2和-9(matrix metalloproteinases，MMP)的表達，MMP-2 和MMP-9 具有降解claudin-5 的作用，并誘導claudin-5 從血管內皮細胞轉移到周圍的膠質細胞。因此，TNF-α 可以通過調節claudin-5 表達、降解水平及分布狀態，改變TJ 的完整性，影響BBB 的通透性。本研究結果顯示，腦缺血再灌注3 h和72 h 時，缺血腦組織中TNF-α 含量顯著增加，EPO 預處理能夠顯著降低TNF-α 含量。

綜上所述，EPO 預處理可能通過降低缺血再灌注后腦組織中TNF-α 含量，使claudin-5 的表達增加，從而恢復TJ 完整性，降低BBB 通透性。

圖1 EPO 預處理對腦微血管內皮細胞TJ 的影響

圖2 EPO 對腦缺血再灌注后claudin-5 分布和表達的影響(×400)

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