GCs 對VD 大鼠行為學及海馬腦區tau 蛋白P-tau 蛋白、Aβ 淀粉樣蛋白表達影響的實驗研究

張艷梅，陳 金，鄔 偉，馬飛煜，楊 佳

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由各血管疾病因素引起的以認知功能損害為主的獲得性智能損害綜合征，為老年期癡呆的主要類型之一。在導致VD 的多種腦血管疾病中，以慢性缺血性腦血管病最多見。研究證實阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)特征性病理改變為老年斑(senile plaque，SP)，超微結構分析證實Aβ 淀粉樣蛋白及P-tau 蛋白為老年斑的主要組分，但有關Aβ 淀粉樣蛋白及P-tau 在慢性缺血所致VD 發病過程中的變化情況卻鮮有報道。傳統醫學認為肉蓯蓉總苷(glycosides of cistanche，GCs)能起到神經保護作用，現代藥理學研究也證實GCs 對VD 患者認知、行為、精神癥狀、日常生活及社會功能都有明顯的改善作用［1，2］。綜上所述，本研究采用2-VO 致局灶性腦缺血法誘導VD 大鼠模型，探討GCs 對VD 模型大鼠認知功能改變及海馬腦區tau 蛋白、P-tau 蛋白、Aβ淀粉樣蛋白表達的影響，為探索VD 發病機制及防治提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 雄性Wistar 大鼠22 只(湖北省實驗動物中心提供，編號00 010751;實驗動物設施使用證號:00014834)，周齡6 w，體質量230～270 g，適應性喂養5 d 后，將大鼠隨機分為6 組:VD 模型組12 只、藥物對照組11 只(奧拉西坦，450 mg/kg/d)、GCs 高劑量治療組12 只(10 mg/kg/d)、GCs 中劑量治療組11 只(5 mg/kg/d)、GCs 低劑量治療組12 只(2.5 mg/kg/d)、假手術組10 只。

1.2 主要試劑及儀器 肉蓯蓉總苷由內蒙古醫科大學藥學院合成;通用型Morris 水迷宮裝置(上海吉量)。tau 蛋白、P-tau 蛋白、Aβ 淀粉樣蛋白試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 模型建立 VD 模型組［3］:10%水合氯醛(350 mg/kg，ip)麻醉后，仰臥固定在手術臺上，常規消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈(common carotid arteries，CCA)，永久性結扎。術后縫合切口，籠內保溫飼養。假手術組:暴露雙側頸動脈后立即縫合。

1.4 Morris 水迷宮實驗 將大鼠放入水迷宮進行定位航行實驗，檢測大鼠學習記憶能力，記錄大鼠找到水下平臺的時間(s)，計算出逃避潛伏期。

1.5 肉蓯蓉總苷干預治療 給藥方式腹腔注射，調整藥物濃度為給藥1 ml/只。模型組動物腹腔注射等體積生理鹽水。連續治療14 d 后，進行Morris 水迷宮試驗及免疫組化實驗。

1.6 大鼠海馬腦區tau 蛋白、P-tau 蛋白、β 淀粉樣蛋白表達研究 頸總動脈結扎2 w 后斷頸處死大鼠先快速取出大鼠腦組織，然后將整個腦皮質向下，沿大腦皮質的腹側靠近小腦端用眼科鑷子剝離大腦皮質，隨后迅速完整剝離鐮刀狀大鼠海馬腦組織，所有操作均冰浴中進行。免疫組化SP 法檢測大鼠海馬腦組織tau 蛋白、P-tau 蛋白、β 淀粉樣蛋白表達，試劑盒均購自深圳市科潤達生物生物工程有限公司，嚴格按照試劑盒操作步驟執行。

實驗步驟具體如下:(1)取材、切片常規脫臘至水;(2)3%雙氧水孵育10 min;試劑A 室溫下孵育15 min;7 μl 一抗用PBS 按1∶80 比例稀釋后濕盒37 ℃孵育2～3 h;(3)試劑B 室溫下孵育15 min;同上法滴加試劑C;(4)DAB 顯色;(5)染色后脫水風干，樹膠封片。OlympusBS-51 顯微鏡觀察，拍照。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮定位航行結果 大鼠造模前均無明顯學習、記憶功能障礙，造模后各組大鼠在5 d 的定位航行訓練中，平均逃避潛伏期顯著改變，總體特點表現為隨著訓練時間的延長潛伏期顯著縮短，各組大鼠訓練后平均潛伏期(見表1、圖1)，從圖中能發現隨著訓練時間的延長，逃避潛伏期明顯縮短;GCs 低、中、高劑量組與模型組相比逃避潛伏期改善更明顯，其中GCs 高劑量組與假手術組的改善在第3、4 天基本相同，說明GCs 具有顯著的改善記憶，保護神經元的作用。VD 模型組大鼠潛伏期明顯長于假手術組(P＜0.01，P＜0.05)，GCs 治療后各組大鼠潛伏期明顯短于VD 模型組(P＜0.01)，但GCs中劑量組與藥物對照組無顯著性差異。

2.2 免疫組化圖像及半定量分析 免疫組化SP 法檢測大鼠海馬腦組織tau 蛋白、P-tau 蛋白、β淀粉樣蛋白表達，標本染色后立即使用OlympusBS-51 顯微鏡觀察，胞漿呈棕黃色染色為tau 蛋白、Ptau 蛋白及Aβ 淀粉樣蛋白。在每個標本的上述各個區域隨機各測量5 個視野，每視野又選取5 個陽性細胞測量平均灰度，取其平均值代表1 例標本該區域的平均灰度值(見圖2)。Image J software v1.4對樣本的熒光強度進行半定量分析。免疫組化染色可見模型組3 種蛋白均有高表達，與假手術組相比有統計學意義(P＜0.05);而GCs 干預后表達灰度均明顯下降，與模型組相比均差異顯著(P＜0.05)，且隨GCs 治療劑量的上升而出現下降趨勢。

表1 各組大鼠定位航行試驗的逃避潛伏期比較(±s)

表1 各組大鼠定位航行試驗的逃避潛伏期比較(±s)

與假手術組比較* P＜0.05;與模型組比較△P＜0.05

圖1 各組大鼠定位航行試驗的逃避潛伏期比較

圖2 各組動物各檢測指標灰度值比較

3 討論

臨床常見老年癡呆的主要類型為AD 和VD，目前的專家共識認為AD 在認知功能障礙發病占首位，而VD 居于其次，流行病學資料顯示中國65 歲以上人群中VD 患病率為1.1%，約占癡呆總患病率的30%［4］，因此探索VD 發病機制及VD 有效防治藥物具有重要現實意義。雙側經總動脈結扎(2-VO)是一種公認研究認知功能障礙大鼠模型，它很好地模擬了VD 病理生理過程［3］。本實驗用2-VO 方法制備VD 大鼠模型，Mories 水迷宮實驗評價各組大鼠行為學改變情況。5 d 的定位航行實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期及游泳路徑顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，表明VD 大鼠學習記憶能力顯著降低。

GCs 從北疆產鹽生肉蓯蓉中提取，主要活性成分為苯乙醇苷類，研究發現GCs 為強抗氧化劑，能有效清除自由基，從而起到神經保護作用并促進神經功能回復，因此對于帕金森病等神經系統變性病有確切療效［5］。本研究發現腹腔注射后大鼠空間探索能力改善明顯，與VD 模型組相比大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，由此表明，GCs 對大鼠空間學習記憶能力有明顯改善作用。奧拉西坦臨床常用于改善認知功能障礙患者的記憶和學習功能，我們的研究表明GCs 組與奧拉西坦藥物對照組逃避潛伏期沒有統計學差異，因而提示可將兩者作為協同作用的藥物共同應用。

Aβ 是由β 淀粉樣前體蛋白(APP)通過蛋白酶解途徑形成長度為39～43 個氨基酸的片段，是構成SP 的主要成分。分子生物學研究證實Aβ 淀粉樣蛋白在細胞基質沉淀聚積可引起神經元細胞毒性及神經元纖維變性［6～8］;tau 蛋白是一種磷酸化蛋白，它連接軸突的微管并維持微管穩定，與細胞內物質轉運等多種功能有關。病理情況下tau 蛋白被異常磷酸化，失去了維持微管運輸的能力，以磷酸化形式(P-tau)沉積在細胞內形成神經原纖維纏結，進而損害認知功能［9～11］。研究報道P-tau 蛋白水平降低可改善癲癇發作造成的認知功能下降［12］，本研究發現tau 蛋白、P-tau 蛋白及Aβ 淀粉樣蛋白在VD 大鼠海馬腦區表達均明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)，而通過GCs 干預上述3 種蛋白表達量均顯著下降(P＜0.05);而Morris 水迷宮測試表明VD 大鼠的智能水平隨時間延長呈顯著下降，說明Aβ 淀粉樣蛋白、tau 蛋白及P-tau 蛋白持續高表達可能是導致大鼠認知功能障礙的原因之一。

綜上所述，VD 模型大鼠認知功能減退與Aβ 淀粉樣蛋白、tau 蛋白及P-tau 表達增加有關，Aβ 淀粉樣蛋白和tau 蛋白相互影響并參與缺血后海馬神經元的損害，造成VD 的發生、發展。

［1］顏貴卉，田金虎，龍本文.肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分的研究進展［J］.中南藥學，2012，10(9):692-695.

［2］He W，Fang T，Tu P.Research progress on pharmacological activities of echinaco-side［J］.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2009，34(4):476-479.

［3］Jia H，Zhang XM，Zhang BA，et al.Dendritic morphology of neuronsin medial prefrontal cortex and hippocampus in 2VO rats［J］.Neurolsci，2012，33(5):1063-1070.

［4］馮銀玲，陳 金，張艷梅，等.GCs 對血管癡呆大鼠認知功能及海馬腦區NF-κB 表達影響的實驗研究［J］.中風與神經疾病雜志，2013，30(11):997-1000.

［5］董亞莉，李劍鋒.不同質量濃度肉蓯蓉總苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經細胞樣細胞的定向分化［J］.中國組織工程研究，2012，16(1):103-106.

［6］梁國聰，石勝良，畢桂南，等.β 淀粉樣蛋白和tau 蛋白在血管性癡呆發病機制中的作用［J］.廣西醫科大學學報，2011，28(5):661-664.

［7］Bookheimer SY，Strojwas MH，Cohen MS，et al.Patterns of brain activation in people at risk for Alzheimen’s disease［J］.NEJM，2009，343(7):450-456.

［8］單守勤，趙 權，張立營，等.阿爾茨海默病患者的腦脊液tau 蛋白及Aβ1-42水平［J］.中國神經精神疾病雜志，2011，37(11):691-693.

［9］Gould RL，Arroyo B，Brown RG，et al.Brain mechanisms of successful compensation during learning in Alzheime’s disease［J］.Neurology，2006，67(6):1011-1017.

［10］Celone KA，Calhoun VD，Dickerson BC，et al.Alterations in memory networks in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease:an independment analysis［J］.Neurosci，2006，26(40):10222-10231.

［11］Sperling R.Functional MRI studies of associative encoding in normal aging，mild cognitive impairment，and Alzheimer’s disease［J］.Ann NYAcad Sci，2009，1097(2):146-155.

［12］李 娜，李文玲，董長征，等.神經肽Y 基因轉染對大鼠癲癇發作及海馬磷酸化tau 蛋白的影響［J］.中華行為醫學與腦科學雜志，2014，23(2):104-106.