睡眠節律紊亂復制Alzheimer 樣大鼠模型的研究探討

李宜培，楊國俊，秦紫芳，靳 力，王 黎

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是多發生于老年人，以進行性認知功能障礙和記憶力下降為主的中樞神經系統退行性病變。AD 發病機制迄今仍未徹底闡明，這與AD 患者相似的動物模型未能真正建立起來密切相關［1］。理想的AD 動物模型應具備神經細胞外β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid peptide，Aβ)沉積所形成的老年斑(senile plaque，SP)、神經細胞內異常磷酸化tau 蛋白聚集構成的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)以及皮質、海馬選擇性的神經元變性和缺失3 個條件［2］。目前AD 動物模型多僅能模擬AD 病變中1～2 個病理學改變，且多數為創傷性的，這與AD 患者臨床起病的漸進性和隱匿性不符。建立能有效復制AD 特征性病理改變且無創性的動物模型是研究AD 發病機制和臨床研發治療藥物所必需的。

已有研究表明［3，4］，大約一半AD 患者發病早期伴有睡眠功能障礙，睡眠節律紊亂可能導致AD 的發生。人和動物的生理節律與光線明暗變化節律密切相關，明暗周期的改變會嚴重影響生物的生理節律，特別是睡眠節律。

本實驗通過持續光照改變大鼠的明暗周期，導致大鼠睡眠節律紊亂，觀察睡眠節律紊亂對大鼠空間記憶和超微結構的改變，海馬組織Aβ 沉積和tau蛋白過度磷酸化的影響，為尋找新的復制AD 動物模型方法提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 清潔級雄性2 月齡Wistar大鼠36 只，體質量200～250 g(華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供)。大鼠經Morris 水迷宮篩選后隨機分為正常對照組(control group，正常晝夜節律)、弱光組(weak light group，WL;24 h 持續光照，照度400 lux)、強光組(strong light group，SL;24 h 持續光照，照度800 lux);每組12 只，20 ℃～25 ℃飼養，自由飲水和攝食。弱光組和強光組大鼠分別光照30 d。

1.2 主要試劑和儀器 Aβ 放免檢測試劑盒(中國人民解放軍總醫院科技開發中心放射免疫研究所)，多聚甲醛(美國BBI 試劑公司)，單克隆抗體PHF-1、單克隆抗體tau-1、多克隆抗體R134d、辣根過氧化物酶標記的二抗、堿性磷酸酶標記的二抗(美國Santa Cruz 公司)，動物組織總蛋白抽提試劑、ECL 化學發光試劑盒(美國Pierce 公司)，顯影定影試劑盒(武漢博士德公司);Morris 水迷宮系統(DMS-2 型，中國醫學科學院藥物研究所)，振蕩切片機(LEICA，S100 型，德國TPI)，全自動γ 免疫計數器(中國西安)，FEI TecnaiG2 透射電子顯微鏡(荷蘭)，半干式電轉膜儀(BIO-RAD)。

1.3 模型構建 大鼠飼養與485 mm×350 mm×200 mm 規格的抗高溫聚碳酸酯鼠籠中，每鼠籠6 只大鼠。弱光組(WL)和強光組(SL)分別用25 瓦和40 瓦白熾燈泡懸于鼠籠中央正上方，距籠底約1 m，光照強度分別為400 Lux 和800 Lux。各實驗組均用照度計測量光照強度并適當調整燈泡高度。人工光照時間為7 pm 至次日7 am;自然光照時間是7 am至7 pm。除光照外，實驗組大鼠飼養環境和正常對照組大鼠相同。

1.4 Morris 水迷宮行為學測試 水迷宮分為4個象限，大鼠每天在每個象限學習4 次，每次時限為60 s，即在60 s 內大鼠未找到平臺者停止記錄，潛伏期記為60 s，大鼠由測試者引導站立平臺上，持續10 s。大鼠從平臺上取下，休息30～60 s 后再進行下一次訓練。記錄第一象限的潛伏期為實驗成績。該實驗從第31 天連續訓練大鼠7 d，記錄第7 天的潛伏期成績來反映大鼠的空間記憶能力。

1.5 淀粉樣蛋白Aβ 含量測定 行為學測試后，每組抽取4 只大鼠處死，剝離海馬，加入0 ℃生理鹽水，冰浴下超聲波勻漿，離心后取上清液，放免法測定Aβ 的含量，自動γ 記數器記錄相關參數。

1.6 海馬電鏡標本的制作及觀察 行為學測試完畢后，每組隨機抽取2 只用于透射電子顯微鏡取材。大鼠麻醉后灌注固定，切取海馬組織塊約1 mm3，經漂洗液充分洗滌后，進行梯度脫水。SPURR 包埋劑包埋后，荷蘭FEI TECNAIG212 透射式電鏡下觀察并照像。

1.7 免疫組織化學法檢測 行為測試后，每組隨機選取2 只大鼠，麻醉后心臟灌注固定腦組織，取腦部組織后固定48 h，振蕩切片。一抗4 ℃過夜，ABC 法，DAB 顯色。檢測各組大鼠總tau 蛋白，pHF-1(識別tau 蛋白磷酸化的Ser396/404 位點)和tau-1(識別tau 蛋白磷酸化的Ser199/202 位點)的表達。

1.8 Western blot 蛋白印跡實驗 行為測試后，每組隨機選取4 只大鼠，麻醉后斷頭，在冰面上剝離海馬，稱重。應用Western blot 技術檢測各組大鼠總tau 蛋白，pHF-1 和tau-1 的表達。

1.9 統計學處理 所有數據使用SPSS 18.0 軟件分析，計量數據用均數±標準差(±s)表示，采用方差分析及q 檢驗比較組間差異，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮行為學測試結果 與正常對照組相比，弱光組和強光組大鼠毛色發黃，無精打采，行動遲緩，處于抑制狀態。其潛伏期延長，具有統計學意義(P＜0.05)(見表1)。從游泳軌跡來看，弱光組和強光組呈曲線式搜索，正常對照組基本成直線式搜索。

2.2 海馬Aβ 放免測定結果 與正常對照組比較，WL 組和SL 組Aβ 含量升高，具有統計學意義(P＜0.05)(見表1)。

2.3 大鼠海馬超微結構的改變 正常對照組大鼠海馬電鏡下可見線粒體結構基本完整，突觸前后膜均一，厚度適中;突觸前膜內的突觸小泡清晰可見，神經軸突內神經細絲清晰，髓鞘板層排列均勻，可見內質網，游離核蛋白體(見圖1)。WL 組和SL組大鼠海馬神經纖維變性，神經元內核變小，游離核蛋白體減少，胞漿內出現大量脂褐素顆粒。線粒體結構破壞，脊模糊，膜破壞;突觸減少、缺失，突觸膜密度降低，且不均一，突觸小泡數量減少，髓鞘崩解，神經元內神經細絲減少(見圖2、圖3)。

2.4 免疫組織化學染色結果 R134d 抗體染色的結果顯示:正常對照組、弱光組、強光組總tau蛋白表達陽性的細胞數比較無明顯差異。與正常對照組比較，弱光組和強光組PHF-1 表達陽性的細胞數在海馬CA3區明顯增多，提示持續光照可引起tau 蛋白Ser396/404 位點發生過度磷酸化;而弱光和強光組tau-1 表達陽性的細胞數在海馬CA3區明顯減少，提示持續光照可引起tau 蛋白的Ser199/202 位點磷酸化增強(見圖4)。

2.5 Western blot 結果 R134d 抗體檢測結果顯示正常對照組、弱光組、強光組總tau 蛋白含量無明顯差異，提示光照不影響總tau 蛋白的含量。與正常對照組比較，弱光和強光組海馬CA3區PHF-1抗體顯色明顯增強，tau-1 抗體顯色明顯減弱，提示持續光照可引起tau 蛋白Ser396/404 和Ser199/202位點發生過度磷酸化。

表1 各組大鼠學習記憶能力和海馬Aβ 含量比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠學習記憶能力和海馬Aβ 含量比較(±s，n=12)

與正常對照組比較* P＜0.05

3 討論

迄今為止，老年性癡呆的發病機制尚未明確，理想的動物模型是研究AD 的基礎。目前，研究者多采用毒性物質注射入大鼠海馬復制AD 模型［5，6］。但這些模型注射藥物過程中均有創傷，和AD 患者的自然發病經過大不相同，而且多數注射模型僅能表現出AD 典型病理改變的某一方面，影響了對AD發病機制的深入研究。這就亟待人們尋找符合AD患者自然發病、非創傷性的而且能反映其特征性病理改變的動物模型［7］。

統計數據表明，大多數AD 患者的起病是隱匿性和漸進性的，大約44%的AD 患者存在睡眠障礙［8，9］，并隨著病情的進展和認知功能的損害而逐步加重，這表明睡眠節律紊亂可能是AD 的病因。

線粒體是存在于真核生物細胞質中的含有核外遺傳物質的細胞器，是細胞的動力化工廠，越來越多的證據表明，AD 的發生與線粒體的結構和功能障礙密切相關［10～12］。突觸是神經元與神經元之間一種特化的細胞連結，是神經元信號傳遞的重要結構。大量研究表明，學習記憶與中樞神經系統突觸的結構和功能的可塑性密切相關。突觸結構的破壞會中斷腦內很多功能通路中的聯系，引起多方面的功能障礙，尤其嚴重的是認知和記憶障礙［13］。研究表明，海馬和皮質突觸聯系的喪失是AD 的一個突出神經病理學改變［14］。突觸脫失是AD 患者重要的病理改變之一，其脫失程度與癡呆嚴重程度成正比，因此被認為是患者認知功能下降的基礎［15］。因此，一個理想的AD 動物模型除了能表現出AD 的兩大病理特征外，還應有超微結構的損傷即線粒體和神經突觸的病理學改變。

本實驗采用持續光照造成大鼠睡眠節律紊亂，結果發現持續光照可以導致大鼠空間記憶能力降低，海馬組織超微結構損傷。而且持續光照可致大鼠海馬Aβ 含量增多，誘導大鼠海馬組織tau 蛋白Ser396/404 和Ser199/202 位點過度磷酸化，異常磷酸化的tau 蛋白主要分布在海馬的CA3區。因此，筆者認為持續光照這種非創傷的方法可以通過模擬AD 患者睡眠功能紊亂，成功復制AD 樣動物模型，是較理想的老年性癡呆模型，適用于AD 發病機制和藥物療效評價的研究。

圖1 正常對照組

圖2 弱光組

圖3 強光組

圖4 各組大鼠海馬tau 蛋白免疫組化結果(標尺:500 μm)

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