黃芪甲苷對(duì)甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織中bcl-2、caspase-3 表達(dá)的影響

隋 璐，李新新，劉 坤，沈 薇，郝 偉，趙春瑩

以甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)為代表的苯丙胺類中樞興奮劑的長(zhǎng)期濫用在世界各地呈上升趨勢(shì)，MA 可導(dǎo)致哺乳動(dòng)物大腦的損傷，目前的研究結(jié)果顯示，多種機(jī)制參與了MA 對(duì)神經(jīng)元的毒性作用，而MA 通過細(xì)胞凋亡機(jī)制的激活導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)病理和行為的變化是神經(jīng)毒性損傷的重要機(jī)制之一［1］。黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)，廣泛用于心血管疾病的治療中，可改善心血管的收縮性，起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用［2］。前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［3］，黃芪甲苷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，并推測(cè)這種保護(hù)作用可能與其抑制氧化應(yīng)激及減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過建立甲基苯丙胺依賴大鼠動(dòng)物模型，觀察黃芪甲苷對(duì)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)分子caspase-3 及凋亡抑制基因bcl-2 表達(dá)的影響，探討黃芪甲苷對(duì)甲基苯丙胺依賴大鼠腦細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，為甲基苯丙胺依賴的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 健康Wistar 雄性大鼠60 只，體重220～250 g，購(gòu)自沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心［許可證號(hào):SCXK(遼2010-0001)］。

1.2 藥品及試劑 甲基苯丙胺由丹東市公安局法醫(yī)中心提供(純度78%);黃芪甲苷購(gòu)于成都康邦生物科技有限公司(純度≥98%，產(chǎn)品批號(hào):120802);兔抗鼠bcl-2 及caspase-3 多克隆抗體購(gòu)自齊安生物制藥有限公司;DAB 顯色試劑盒、SABC 免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士得生物制劑有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Superscrip 公司;引物、DNAmarker 由南京金斯特生物公司。

1.3 動(dòng)物分組、造模及給藥 實(shí)驗(yàn)前將Wistar大鼠在恒溫恒濕的飼養(yǎng)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由飲水進(jìn)食。飼養(yǎng)結(jié)束后將60 只大鼠隨機(jī)分成4 組，每組15 只。分別為A 組:空白對(duì)照組;B 組:MA 依賴模型組;C 組:黃芪甲苷(10 mg/kg)+MA 干預(yù)組;D組:黃芪甲苷(20 mg/kg)+MA 干預(yù)組。MA 依賴組造模方法參照文獻(xiàn)［4］:MA 腹腔注射，逐日劑量遞增(0.5、1、2、8、10、15 和20 mg/kg)，每天兩次(8:00，20:00)給藥，1 w 后開始維持20 mg/kg 的劑量，連續(xù)給藥14 d;黃芪甲苷+MA 干預(yù)組在造模的同時(shí)每天一次黃芪甲苷灌胃給藥干預(yù)治療，黃芪甲苷的劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg;空白對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水代替MA。

1.4 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 蛋白的表達(dá) 證實(shí)模型組大鼠對(duì)甲基苯丙胺形成藥物依賴后［5］，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材。將各組大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 mg 腹腔麻醉，迅速斷頭取全腦，沿矢狀縫切取一半腦組織，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，在大腦半球距離中央溝前2 cm間取額葉腦組織，30%蔗糖脫水，石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片厚5 μm，嚴(yán)格按照SABC 免疫組化法試劑盒說明操作，檢測(cè)bcl-2、caspase-3 表達(dá)水平。在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為bcl-2 與caspase-3 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞。結(jié)果用Motic Images Advanced 3.2 圖像分析系統(tǒng)采集照片，并進(jìn)行定量分析。

1.5 Bcl-2 與caspase-3 mRNA 檢測(cè) 按照Trizol 試劑盒說明書提取腦組織RNA，并用primer5 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。大鼠bcl-2:F5’-GTCCCGCCTCTTCACCTT-3’，R5’-CCCACTCGTAGCCCCTCT-3’(產(chǎn)物為407 bp)。大鼠caspase-3:F5’-ACG GTA CGC GAA GAA AAG TGAC-3’，R 5’-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCTG-3’(產(chǎn)物為282 bp)。大鼠β-action:F5’-GTGGGGCGCCCAGGCACCA-3’，R 5’-GCTCGGCCGTGGTGGTGAAGC-3’(產(chǎn)物為493 bp)，逆轉(zhuǎn)錄體系按照Super scripⅡcDNA 合成試劑盒說明。合成的cDNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＞酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)PCR:cDNA2 μl，dNTP2 μl，10×RT buffer 6 μl，正反義引物(25 mmol/L)各 1 μl，β-actin(25 μmol/L)各1 μl，Tap 酶0.4 μl，加去離子水至25 μl。反應(yīng)參數(shù)95 ℃5 min;95 ℃30 s;55 ℃30 s;72 ℃30 s;30 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，Tanon-2500R 凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行拍照掃描分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩均數(shù)的比較采用t 檢驗(yàn)，均以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)bcl-2、caspase-3 蛋白的表達(dá) 空白對(duì)照組bcl-2 陽性細(xì)胞呈少量表達(dá);MA 依賴模型組bcl-2 陽性細(xì)胞表達(dá)增多，部位主要分布于額葉皮質(zhì)，與空白對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。黃芪甲苷(20 mg/kg)治療組bcl-2 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，與MA 依賴模型組相比，差異有顯著性(P＜0.01);而黃芪甲苷(10 mg/kg)治療組bcl-2 陽性細(xì)胞表達(dá)增加不明顯，與MA 依賴模型組相比，無顯著性差異(P＞0.05)。空白對(duì)照組可見caspase-3 陽性細(xì)胞呈少量表達(dá);MA 依賴模型組caspase-3 陽性細(xì)胞表達(dá)增多，部位主要分布于額葉皮質(zhì)，與空白對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。黃芪甲苷(20 mg/kg)治療組caspase-3 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，與MA 依賴模型組相比，差異有顯著性(P＜0.01);而黃芪甲苷(10 mg/kg)治療組caspase-3 陽性細(xì)胞表達(dá)降低不明顯，與MA 依賴模型組相比，無顯著性差異(P＞0.05)(見表1)，結(jié)果(見圖1)。

2.2 各組大鼠腦組織中bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 模型組大鼠腦組織的bcl-2 mRNA、caspase-3 mRNA 表達(dá)增多，與空白對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.01);黃芪甲苷各劑量治療組大鼠腦組織的bcl-2 mRNA 表達(dá)增加、caspase-3 mRNA表達(dá)明顯減少，二者高劑量治療組與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01);但低劑量治療組的作用不如高劑量組，與模型組比較均無顯著性差異(P＞0.05)(見表2)，結(jié)果(見圖2)。

表1 各組大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)的比較(±s，n=15)

表1 各組大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)的比較(±s，n=15)

與空白組比較* P＜0.01;與MA 依賴模型組相比較△P＜0.01

表2 黃芪甲苷對(duì)MA 依賴大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響(±s，n=15)

表2 黃芪甲苷對(duì)MA 依賴大鼠腦組織bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響(±s，n=15)

與空白組比較* P＜0.01;與MA 依賴模型組相比較△P＜0.01

圖1 各組大鼠腦組織bcl-2 蛋白表達(dá)免疫組化(×400)

圖2 各組大鼠腦組織caspase-3 蛋白免疫組化(×400)

3 討論

目前研究已表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是甲基苯丙胺神經(jīng)毒性作用中的分子機(jī)制之一，而凋亡相關(guān)基因bcl-2 和caspase-3 蛋白在MA 中毒后的表達(dá)異常也說明了這兩種蛋白參與了MA 誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制。MA 是一種帶正電荷的脂溶性分子，進(jìn)入線粒體后容易潴留其中，破壞ATP 酶的活性和線粒體膜的完整性，從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，繼而啟動(dòng)caspase 級(jí) 聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［6］。caspase-3 屬于半胱氨酸蛋白酶，是最為關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，在凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起到樞紐作用［7，8］。bcl-2 是一種強(qiáng)有力的凋亡抑制基因，bcl-2 可通過穩(wěn)定線粒體膜、阻止caspase-3 激活的作用抑制細(xì)胞凋亡，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用［9］。

本研究結(jié)果顯示，MA 依賴模型組大鼠的腦組織bcl-2 蛋白表達(dá)和bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯增加，可能是機(jī)體對(duì)抗凋亡所做出的一種應(yīng)激反應(yīng)。黃芪甲苷治療組大鼠腦組織的bcl-2 表達(dá)高于MA 依賴模型組，提示黃芪甲苷干預(yù)治療可使受損傷的腦組織bcl-2 蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，但通過何種途徑上調(diào)bcl-2 表達(dá)，還有待于進(jìn)一步研究。而caspase-3 蛋白和caspase-3 mRNA 在MA 依賴模型組大鼠的腦組織表達(dá)增多，說明損傷刺激引發(fā)了caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞凋亡增加。在黃芪甲苷治療組大鼠腦組織的表達(dá)減少，提示黃芪甲苷可通過降低caspase-3 蛋白的表達(dá)和活化，抑制MA 誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ)是從豆科草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根中提取、分離得到的單一成分，是中藥黃芪的指標(biāo)性成分，具有提高機(jī)體免疫力、保護(hù)腦組織等作用［2］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷可抑制腦細(xì)胞凋亡，其抗凋亡作用的機(jī)制可能是通過抑制凋亡始動(dòng)因子caspase-3 并通過上調(diào)抑制凋亡基因bcl-2 蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示了黃芪甲苷具有劑量依賴性，大劑量組的黃芪甲苷才有抑制腦細(xì)胞凋亡的作用。

［1］Huang YN，Wang JY，Lee CT，et al.Ascorbate attenuates methamphetamine neurotoxicity through enhancing the induction of endogenous heme oxygenase［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2012，265(2):241-252.

［2］Li XH，Wang HX.Effect of astragaloside IV in cardiovascular disease［J］.Adv Cardi ov Dis(心血管病學(xué)進(jìn)展)，2011，32(1):132-136.

［3］隋 璐，劉 坤，沈 薇，等.黃芪甲苷對(duì)甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織中NO、SOD 和MDA 的影響［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21(26):16-18.

［4］李新新，楊秀麗，陳曉雷，等.Caspase-3 抑制藥對(duì)甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織NO 和SOD 及MDA 的影響［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33(4):426-428.

［5］張麗華，張東宣，志 恒，等.建立大鼠甲基苯丙胺的神經(jīng)精神毒性模型［J］.中國(guó)藥物依賴性雜志，2013，22(2):95-97.

［6］李新新，李 輝，陳曉雷，等.z-DEVD-fmk 干預(yù)甲基苯丙胺依賴大鼠腦細(xì)胞凋亡與bcl-2 蛋白的表達(dá)［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42(8):730-733.

［7］Chaudhry P，Singh M，Parent S，et al.Prostate apoptosis response 4(Par-4)，a novel substrate of caspase-3 during apoptosis activation［J］.Molecular and Celluar Biology，2012，32(4):826-839.

［8］Vecran F，Boidoy R，Solary E，et al.A short caspase-3 isoform inhibits chemotherapy-induced apoptosis by blocking apotosome assembly［J］.Plos One，2011，6(12):29058-29065.

［9］Xi HJ，Zhang TH，Tao T，et al.Propofol improved neurobehavioral outcome of cerebral ischemia-reperfusion rats by regulating bcl-2 and Bax expression［J］.Brain Res，2011，1410(9):24-32.