白藜蘆醇對β-淀粉樣蛋白致小鼠學習記憶障礙改善作用的機制研究

王 宇，黃 清，董明睿，劉尊敬

阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與衰老密切相關、以進行性認知功能障礙和記憶力損傷為主要癥狀的神經系統退行性疾病。其主要病理改變為以β 淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑和tau 蛋白異常聚集形成的神經纖維纏結。近年來的研究表明AD 發病與炎癥密切相關，在AD 患者和動物模型腦內有大量活化的小膠質細胞［1］。另外在AD 中晚期腦內出現大量被Aβ 激活的膠質細胞，并伴隨有炎癥因子表達的增加以及補體系統的激活。

白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，以往的研究發現，白藜蘆醇有抗血小板聚集、抗氧化、抗炎癥、抗衰老及預防腫瘤等作用［2］。近年來研究發現白藜蘆醇具有神經保護作用。可明顯延緩神經軸突變性［3］，抑制Aβ 誘導的海馬神經元的凋亡，改善AD 動物模型學習記憶障礙［4］。因此，白藜蘆醇在AD 的治療方面具有重要的應用價值，然而，白藜蘆醇神經保護作用的分子機制并不清楚。有研究顯示白藜蘆醇對LPS 引起的小膠質細胞激活介導的神經炎癥有抑制作用。基于神經炎癥在AD 發病中的重要作用，本研究主要從抑制神經炎癥的角度對白藜蘆醇治療AD 的分子機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 小鼠側腦室注射Aβ 建立AD 模型 健康雄性清潔級ICR 小鼠，體重25～30 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。Aβ1-42(Sigma 公司)用無菌三蒸水配制成0.5 μg/μl，放入37 ℃孵位儀上，沿著中線切開頭部皮膚，暴露前囟和人字縫，用粗針頭在左側側腦室處鉆破頭骨，相對坐標為前囟后2 mm，中線左側1.5 mm，硬腦膜下2.5 mm，向小鼠左側側腦室內注射Aβ1-423 μl(1.5 μg)/只，在5 min內注射完，停針10 min，然后緩慢拔出注射針，速度為1 mm/min，將適量青霉素粉末涂抹于傷口表面，然后用手術線將切口縫合，待小鼠清醒后放入籠中。假手術組大鼠于坐標為前囟后2 mm，中線左側1.5 mm，硬腦膜下2.5 mm 處注射3 μl 無菌三蒸水。手術后，將側腦室注射Aβ1-42小鼠隨機分為假手術組、模型組、白藜蘆醇給藥組，每組15 只小鼠。手術后第2 天灌胃給有小鼠白藜蘆醇50 mg/kg，假手術組和模型組給予同樣劑量的0.5%CMC-Na，每天一次，連續給藥18 d。實驗中所有操作均遵循北京市實驗動物倫理委員會的規定。

1.2 Morris 水迷宮實驗 Morris 水迷宮裝置為一個直徑120 cm，水深40 cm，內表面糊有一層黑紙的圓形水池(中國醫學科學院藥物研究所)，水溫23 ℃～25 ℃，室內溫度控制在26 ℃～28 ℃。將水箱隨機分為四個象限，實驗時平臺位置固定不變，置于第二象限中央，低于水面1～2 cm。室內四周墻壁上做上明顯的標記，以便小鼠能夠根據標記辨認方向。實驗過程中室內所有物體的擺放位置同定，以免對小鼠產生干擾。實驗歷時6 d，每天進行兩次。前5 d 為定位航行實驗(place navigation)，將小鼠面朝池壁隨機先后從兩個象限輕輕放入水中，避免應激和將小鼠頭部浸入水中，同時記錄小鼠1 min內找到安全平臺的潛伏期，并讓其在安全平臺上停留30 s，然后取出放回籠子。若小鼠120 s 內未找到安全平臺，則潛伏期記為120 s。第6 天進行空間探索實驗，撤去安全平臺，隨機選擇一個象限將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠120 s 內的游泳軌跡。

1.3 海馬神經元尼氏染色 行為學實驗結束24 h 后，每組隨機選取5 只小鼠，用含3%蔗糖和4%多聚甲醛的PBS 溶液心臟灌流。然后斷頭取腦，放至含0%蔗糖和%多聚甲醛的PBS 固定液中放置24 h 以上至腦組織塊下沉。將固定好的腦組織置于液氮中直至全部變白。冰凍切片機預冷至-20 ℃，切片厚度為20 μm，直接貼片于載玻片上，在焦油固紫工作液中染色15～30 min，蒸餾水洗去浮色，依次置入70%、80%、95%酒精中分色，鏡下觀察尼氏顆粒清晰，然后切片入特殊分色液褪背景。酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察尼氏染色情況。

1.4 ELISA 檢測海馬炎癥因子 小鼠于行為學測試24 h 后斷頭取海馬，用非變性裂解液提取海馬總蛋白。用ELISA 試劑盒(R＆D 公司)檢測TNFα 和IL-1β 的含量，按說明書進行操作，結果以pg/g濕組織表示。

1.5 Western blot 結果 小鼠斷頭取腦，分離海馬，用胞漿-胞核裂解液(北京普利萊公司)提取胞核蛋白。提取液離心后煮沸5 min。10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉移到PVDF 膜上。轉移上蛋白的PVDF 膜在5%的TBST 配制的脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，室溫下與TBST 稀釋的NF-κB一抗(Abcam 公司)孵育2 h，用TBST 洗3 遍。然后在TBST 稀釋的辣根過氧化酶偶連的二抗中孵育1.5 h，洗3 遍后，在LAS3000 化學發光系統(日本富士公司)檢測，Gel-Pro Analyzer 4.0 分析條帶灰度。

1.6 數據分析 用SPSS 13.0 進行統計分析。數據以均數±標準差(±s)表示，不同組間的變化用One-Way ANOVA 分析，然后用LSD-SNK 檢驗。P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對Aβ 側腦室注射所致學習記憶障礙的改善作用 小鼠側腦室注射Aβ 后找到平臺的潛伏期(P＜0.01)和穿越平臺的次數(P＜0.01)與假手術組小鼠相比明顯延長，提示Aβ 造成小鼠學習記憶能力障礙。口服給予白藜蘆醇50 mg/kg，連續18 d，小鼠找到平臺的潛伏期與模型組小鼠相比時間明顯縮短(P＜0.05)(見圖1A)，穿越平臺的次數明顯增多(P＜0.05)(見圖1B)，表明白藜蘆醇對小鼠學習記憶功能障礙有明顯的改善作用。

2.2 白藜蘆醇抑制小鼠海馬神經元丟失 尼氏體是神經元的特征性結構之一，存在于神經元胞體和樹突內，尼氏染色可反映神經元的病變。本實驗結果顯示，Aβ 側腦室注射后，與假手術組相比海馬神經元有大量的尼氏體丟失，陽性染色面積明顯降低(P＜0.01)，正常結構模糊，神經元呈灰白染色，正常形態被破壞。白藜蘆醇給藥后尼氏體陽性染色面積與模型組相比明顯增加(P＜0.05)，神經元損傷明顯減輕，細胞染色較深，存在正常形態(見圖2)。表明白藜蘆醇可減輕AD 模型神經元的損傷。

2.3 白藜蘆醇抑制海馬TNF-α 和IL-1β 的產生 腦內小膠質細胞活化后可產生并釋放多種炎癥因子，如TNF-α 和IL-1β 等，造成神經元損傷、導致神經功元功能障礙。結果顯示，Aβ 側腦室注射小鼠與假手術相比海馬TNF-α 和IL-1β 的量明顯提高(P＜0.01)，口服給予小鼠白藜蘆醇可明顯降低海馬TNF-α(P＜0.01)和IL-1β(P＜0.05)的量(見圖3)。以上結果表明白藜蘆醇對小鼠學習記憶障礙的改善作用可能與其抑制神經炎癥有關。

2.4 白藜蘆醇通過抑制NF-κB 信號通路抑制神經炎癥 NF-κB 是介導炎癥的重要信號轉導通路，被激活后，NF-κB p65 轉位入核，與特異性轉錄調節元件結合，引起多種細胞因子、趨化因子的轉錄和表達，教導炎癥反應。本結果顯示，小鼠側腦室注射Aβ 可引起NF-κB p65 轉位入核量明顯增加(P＜0.01)，口服白藜蘆醇可顯著降低NF-κB p65 轉位入核(P＜0.05)(見圖4)。推測白藜蘆醇通過抑制NF-κB 信號通路而抑制腦內炎癥反應，進而改善AD模型小鼠學習記憶障礙。

圖1 白藜蘆醇對Aβ 側腦室注射所致學習記憶障礙的改善作用

圖2 白藜蘆醇抑制小鼠海馬神經元丟失

圖3 白藜蘆醇抑制海馬TNF-α 和IL-1β 的產生

圖4 白藜蘆醇抑制NF-κB 炎癥信號通路

3 討論

近年來研究發現神經炎癥在AD 發病中起著重要作用，是AD 的重要病理特征之一。AD 患者死亡后尸檢結果顯示，在其腦中Aβ 沉積部位聚集有大量活化的小膠質細胞和星形膠質細胞［5］。目前關于AD 發病機制的眾多假說中，Aβ 和炎癥反應相互促進造成的神經毒性被認為是AD 發病過程中最重要的病理機制［6］。本研究發現小鼠側腦室注射Aβ可引起明顯的神經炎癥反應，表現在炎癥因子TNFα 和IL-1β 的產生和釋放明顯增加、炎癥信號通路NF-κB 激活，炎癥引起的神經毒性導致海馬神經元的丟失，最終導致小鼠學習記憶功能障礙。白藜蘆醇灌胃給予小鼠可明顯抑制上述炎癥反應和海馬神經元的丟失以及小鼠學習記憶障礙，表明白藜蘆醇能改善AD 學習記憶障礙的作用，作用機制可能與其抑制神經炎癥有密切的關系。

中樞神經系統中膠質細胞活化后可產生并釋放多種細胞因子，趨化因子和化學因子等毒性介質，是造成神經損傷、導致神經功能障礙的主要因素，與AD 發病密切相關。TNF-α 主要由活化的膠質細胞及神經細胞和血管內皮細胞產生，通過與神經元上的TNF 受體-1 結合，激活膜內的死亡結構域，導致神經元凋亡［7］。IL-1β 主要由活化的小膠質細胞和星形膠質細胞產生，在高濃度時可使活化的膠質細胞產生具有興奮性神經毒性的谷氨酸，有直接的細胞毒作用。IL-1β 還可誘導星形膠質細胞的活化，使其產生IL-6 等，形成惡性循環［8］。NF-κB 信號轉導通路是調節膠質細胞活化和炎癥介質表達的關鍵調節因子。NF-κB 是在膠質細胞介導的神經炎癥中起重要作用的轉錄因子［9］，阻斷NF-κB 的轉錄活性可以明顯抑制NO、PGE2、TNF-α 和IL-1β 等炎癥因子的表達［10］。因此，對炎癥因子基因表達的抑制效應通常被認為是與NF-κB 活性的抑制有關［11］。本研究發現白藜蘆醇可明顯抑制海馬區TNF-α 和IL-1β的產生和釋放。值得一提的是白黎蘆醇可明顯抑制NF-κB p65 核轉位，從而抑制NF-κB 信號通路的激活，表明白藜蘆醇具有較強的抑制炎癥的作用。

海馬和皮質神經元凋亡是AD 重要的神經病理學特性，在AD 的發病機制中起著關鍵作用［12］。在AD 患者腦中神經元的丟失可能是Aβ 的毒性造成的，也可能是其作為蛋白大分子激活的膠質細胞釋放的炎癥介質的神經毒素引起的。腦內的膠質細胞也對局部的損害因素發生反應，增殖、活化并產生大量炎癥因子，從而啟動并增強炎性反應過程，加重神經損傷［13］。本研究通過對小鼠海馬尼氏染色發現小鼠側腦室注射Aβ 后海馬神經元明顯丟失，而當用白藜蘆醇抑制神經炎癥后海馬神經元丟失就明顯降低，這與白藜蘆醇抑制Aβ 引起神經炎癥有關。以上結果表明白藜蘆醇通過抑制神經炎癥而抑制神經元的損傷。

綜上所述，白藜蘆醇對AD 具有治療作用，其作用機制可能與抑制炎癥反應，進而保護神經元有關。

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