SOD1-G93A 小鼠中樞神經系統SIRT1 的變化及白藜蘆醇對其的影響

于莎莎，吳紅然，李園園，杜 娟，宋學琴

ALS(肌萎縮側索硬化)是累及上、下運動神經元的一種慢性進行性神經變性疾病，臨床上常表現為肌無力、肌萎縮，而感覺和括約肌的功能一般不會受到影響。目前對于ALS 的病因及發病機制還不是十分清楚，近年來研究提出一些假說，如遺傳機制、氧化應激、谷氨酸興奮性毒性、線粒體功能障礙、神經營養因子障礙、自身免疫機制、病毒感染及環境因素等，至今病因未明。而無論是哪種病因假說，其最終結果都是導致細胞壽命的縮短，使神經細胞提早死亡。延長神經細胞的壽命成為神經變性疾病研究的熱點，長壽蛋白(SIRT1)是釀酒酵母菌SIR2(SIR2 基因編碼的蛋白是NAD+依賴的去乙酰化酶，參與延長酵母菌壽命)基因同源的NAD+依賴的一組酶。SIRT1 能夠延長細胞壽命。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是多酚類化合物，它主要來源于蓼科植物的根莖中，具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗心血管疾病等作用，已被證實可以激活SIRT1 并且廣泛用于各種實驗中，是近來研究較多的SIRT1 的激動劑，Res 可以激活SIRT1，在神經退行病等疾病中具有保護作用。SIRT1 與白藜蘆醇在ALS 中的研究還未見廣泛報道，本文利用SOD1-G93A 轉基因小鼠作為模型，檢測隨著疾病進展，SOD1-G93A 小鼠運動皮質及腰髓中SIRT1 的動態變化，以及白藜蘆醇對SIRT1 的影響，探討白藜蘆醇對ALS 的干預程度。

1 材料和方法

1.1 分組 選取表達人突變基因SOD1 的SOD1-G93A 轉基因小鼠及其野生型小鼠為實驗對象。分為對照組、實驗組及處理組，對照組選取90 d 野生型小鼠。實驗組則選取經PCR 鑒定結果為SOD1-G93A轉基因的小鼠。根據其時間點分為3 組:(1)癥狀前期組;(2)癥狀早期組;(3)終末期組。處理組選取經PCR鑒定結果為SOD1-G93A 轉基因的70 d 的小鼠，根據給予3 種不同的處理方式，分為白藜蘆醇組(Sigma，101237259，30 mg/kg/d)、溶劑組(同等體積乙醇生理鹽水溶液)、空白組(未予任何處理)，根據處理時間不同每種處理方式又分為2 個亞組，處理時間為20～30 d、50～60 d。共6 組，每組6 只小鼠，3 只用于蛋白定量，3只用于免疫組織化學染色。

1.2 Western blot 技術 檢測不同時期SOD1-G93A 轉基因小鼠運動皮質及腰髓中SIRT1 水平及給予白藜蘆醇后SIRT1 蛋白的表達情況。

1.3 免疫組織化學方法 觀察不同時期SOD1-G93A 轉基因小鼠運動皮質及腰髓前角細胞中SIRT1的表達和給予白藜蘆醇后SIRT1 免疫活性的變化。

1.4 統計學分析 采用SPSS 13.0 統計軟件進行統計學處理。實驗數據以均數±標準差(±s)表示。多組間均數差異性比較采用單因素方差分析。P＜0.05 即認為有統計學意義(檢驗水準為P=0.05)。

2 結果

2.1 Western blot 結果 隨著ALS 疾病的進展，SOD1-G93A 小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 的表達量增加;與對照組相比，60 小鼠運動皮質及腰髓中SIRT1 表達量無明顯變化，癥狀早期及終末期SIRT1 表達量增多，差別具有統計學意義(P＜0.05)。癥狀早期組與終末期相比SIRT1 表達量差別無統計學意義(P＞0.05)(見圖1、表1)。在癥狀早期SOD1-G93A 小鼠運動皮質與腰髓中，溶劑組SIRT1 表達量最高，白藜蘆醇組居中，空白組最低，白藜蘆醇組較溶劑組SIRT1 表達量減少，結果有統計學意義(P＜0.05)，白藜蘆醇組SIRT1 表達量較空白組有增高趨勢，但無統計學意義(P＞0.05)，溶劑組較空白組SIRT1 表達量增加，結果具有統計學意義(見圖2、表2)。在終末期SOD1-G93A 小鼠運動皮質與腰髓中，白藜蘆醇組、溶劑組SIRT1 表達量均較空白組有增高趨勢，但各組間無統計學差異(P＞0.05)(見圖3、表3)。

2.2 免疫組織化學結果 隨著ALS 疾病的進展，小鼠腰髓與運動皮質中，60 d 組SIRT1 表達較對照組無明顯差別，癥狀早期及終末期SIRT1 表達較對照組增加(見圖4)。癥狀早期SOD1-G93A 小鼠腰髓與運動皮質中，白藜蘆醇組SIRT1 較溶劑組表達減少，白藜蘆醇組較空白組表達增高，但無明顯差別;溶劑組較空白組SIRT1 表達增多;終末期白藜蘆醇組SIRT1 表達較溶劑組減少，較空白組增加，溶劑組較空白組增加(見圖5)。

表1 各期SIRT1 的比較

表2 不同處理至發病早期SIRT1 的比較

表3 不同處理至終末期SIRT1 的比較

圖1 Western blot 示SOD1-G93A 小鼠運動皮質與腰髓中不同時期SIRT1 表達量

圖2 Western blot 給予3 種不同處理方式至癥狀早期時SOD1-G93A 小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 表達量

圖3 Western blot 給予3 種不同處理方式至終末期時SOD1-G93A小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 表達量

3 討論

ALS 是一種成人發病的進行性、致死性的神經退行性疾病，以大腦與脊髓中運動神經元選擇性丟失為特征，家族性ALS 約占運動神經元病的5%～10%，其中約20%與銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)遺傳突變有關，人們發現，過度表達人類突變SOD1 基因的小鼠，具有與人類ALS 患者相似的表現，有助于我們理解研究人類ALS。sirtuins 是一類與釀酒酵母菌沉默調節因子2(SIR2)基因高度同源的NAD+依賴的、進化過程非常保守的去乙酰化酶類。它參與調節許多細胞功能，如調節代謝、進行染色體維護、延長壽命等。哺乳動物SIR2 基因同源蛋白為SIRT1，與SIR2 具有相同的酶活性，可以對多種蛋白去乙酰化，包括核蛋白與胞漿蛋白。SIRT1 加強了細胞的修復機制及給予其時間來維持細胞功能，這與神經退行性疾病具有高度相關性，在神經元丟失中起重要作用，特別是在大腦這類神經不可再生的組織中［1］。

SIRT1 與神經退行性疾病密切相關。有學者研究在PD 中，SIRT1 表達量增多能減少MPP+所致中腦多巴胺神經元的丟失［2］，在AD 中，變性神經元中β 淀粉樣蛋白沉積與神經元間的神經纖維纏結是AD 的主要病理特征，SIRT1 可以去乙酰化調節NFκB，減少Aβ 蛋白生成，來起到神經保護的作用［3］。在亨廷頓氏舞蹈癥中亦有重要保護作用，亨廷頓患者基因突變導致了紋狀體區錯誤翻譯蛋白(稱為亨廷頓蛋白)的異常聚集，這些錯誤翻譯折疊的蛋白聚集成塊狀物沉積在紋狀體神經元中，造成神經元的死亡，SIRT1 可以調節核轉錄沉默，通過對一系列相關蛋白去乙酰化，修復染色體及調節轉錄因子活性而產生保護效應［4，5］，在ALS 以及AD 的小鼠模型中，也有人證實，SIRT1 阻止了神經元的變性［6］。本實驗結果顯示，在癥狀早期及終末期G93A 轉基因小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 表達均明顯增多，說明SIRT1 隨著神經元的退行過程其表達是增加的，而終末期腰髓組織中神經元數目減少，星形膠質細胞增生，有關文章指出在細胞受氧化應激等損傷時，星形膠質細胞中SIRT1 的表達就會增加，進而保護細胞不受損害，而本實驗ALS 小鼠模型中，終末期腰髓中運動神經元中氧化應激導致嚴重細胞受損，星形膠質細胞中SIRT1 表達增加，所以終末期總體SIRT1 表達增多［7］。這與免疫組織化學染色結果相符，癥狀早期G93A 轉基因小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 表達增高，終末期也增高，說明SIRT1 保護性作用是隨著疾病發展增加的。這些都支持SIRT1 是與ALS 中運動神經元的丟失是相關的，并且SIRT1 可能在ALS 中起到了多種保護作用，減少神經細胞凋亡。

白藜蘆醇是第一個被發現可以激活SIRT1 的多酚類化合物，它存在于紅酒與葡萄中，白藜蘆醇具有抗氧化及抗炎的功效。它可以直接或間接地激活SIRT1，這點在體內及體外模型中都曾被證實過［8］。在朊蛋白病的細胞模型中，激活SIRT1 可以起到保護細胞的作用，而這一作用正是通過給予白藜蘆醇來實現的，并且是通過SIRT1 激活自噬(Autophagy)來減少細胞凋亡，達到保護神經元的作用。并且SIRT1 可誘導自噬-溶酶體途徑［9］。PD 中，白藜蘆醇可以激活SIRT1-PGC-1α 途徑阻止線粒體受氧化應激損傷，減少中腦黑質神經元的退化［10］，在1 甲基4 苯基吡啶(MPP+)導致的PD 模型中，白藜蘆醇通過SIRT1/AMPK/Autophagy 途徑來保護線粒體進而維持神經元生理功能［11］，以上支持SIRT1 具有神經保護作用，白藜蘆醇作為其激活劑增強其作用。但本實驗結果與許多之前的結果有所不同，Western blot 結果示癥狀早期當給予藥物白藜蘆醇后，G93A轉基因小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 表達量相對于空白組并無明顯變化，較溶劑組減少，而給予溶劑組較空白組SIRT1 表達量較白藜蘆醇組及空白組明顯增加，免疫組織化學示癥狀早期給予白藜蘆醇后，G93A 轉基因小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 表達較溶劑組降低，較空白組稍高，這結果表明乙醇可以使G93A 轉基因小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 的表達量增多，白藜蘆醇不僅沒有使SIRT1 表達量增多，甚至使SIRT1 的表達量降低了，難道乙醇對SIRT1 有激活作用?有實驗者報道在慢性酒精喂養的酒精肝病的小鼠模型中，胃內灌注給予乙醇后，導致SIRT1的表達升高，并且其靶蛋白PGC-1α 的表達也被上調，結果說明乙醇可以使SIRT1 表達量增多，但其機制未明確闡明，同時給予白藜蘆醇卻導致SIRT1 表達量不再上升，并且白藜蘆醇無對抗乙醇導致的肝臟細胞的壞死與纖維化的功效，說明白藜蘆醇沒有起到激活SIRT1 及保護肝臟細胞的有益作用，然而，在非酒精性脂肪肝的模型中，給予白藜蘆醇可以減少脂肪沉積，使AMPK 磷酸化增加，并且腹型肥胖和胰島素抵抗被顯著改善［12，13］，這說明在某些疾病模型中，乙醇可以激活SIRT1，并且白藜蘆醇與乙醇合用并不會激活SIRT1，甚至會降低SIRT1，這說明白藜蘆醇與乙醇可能會相互影響，但具體機制還需繼續深入探討。此外在肝癌細胞與初級人肝細胞中，白藜蘆醇調節SIRT1 的方式是不同的，在正常的肝細胞中，白藜蘆醇可以激活尼克酰胺磷酸核糖轉移酶(NAMPT，可以調節SIRT1 活性)和SIRT1，但是在肝癌細胞中，白藜蘆醇不能夠激活NAMPT 和SIRT1，而這時白藜蘆醇產生的是抑制SIRT1 的效應，這與在正常肝細胞中白藜蘆醇對SIRT1 的調節是相反的，此時白藜蘆醇不再作為SIRT1 的激活劑，推測在此細胞模型中，SIRT1 不再僅僅依賴NAD+的調節，而是受到各種蛋白的共同調節。有小部分學者認為白藜蘆醇激活SIRT1 的機制還是備受爭議，但機制還尚未研究透徹。

同樣在SOD1-G93A 轉基因小鼠中，給予小鼠白藜蘆醇后，并未起到相應的保護神經的作用，說明在體內模型中，白藜蘆醇的作用機制更加復雜，可能不是通過一條通路影響細胞功能，是通過多個信號途徑，影響多個相關蛋白的活性及表達，最終對細胞產生的是一個綜合效應，其具體機制值得繼續深入研究。在ALS 的動物模型中，推測可能存在與肝細胞中類似的分子機制，使得白藜蘆醇未對SIRT1 起到應有的激活作用，反而起到抑制作用，所以隨著疾病的發展，SIRT1 在ALS 小鼠中運動皮質與腰髓中的表達增加，保護運動神經元，然而對于白藜蘆醇對SIRT1 的作用機制和白藜蘆醇對ALS 有無治療效果，還需做進一步深入研究。

4 結論

通過實驗，我們發現隨著ALS 疾病的進展，SOD1-G93A 轉基因小鼠運動皮質及腰髓中SIRT1 含量逐漸增加，推斷隨著疾病的發展，各種原因導致神經元細胞數目的減少與功能的退化，SIRT1 表達量逐漸增加，起到一定的保護作用，這種保護作用，使SIRT1 成為ALS 新的治療靶點的可能;給予白藜蘆醇后的SOD1-G93A 轉基因小鼠運動皮質及腰髓中，均無明顯上調SIRT1 的效應，而單純給予溶劑的SOD1-G93A 轉基因小鼠其運動皮質與腰髓SIRT1 表達上調，白藜蘆醇沒有起到預期的保護作用，說明白藜蘆醇可能未起到激活SIRT1 的作用甚至下調了SIRT1的表達，對今后對ALS 的研究有一定的參考意義。

圖4 免疫組織化學示疾病不同時期SOD1-G93A 小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 表達

圖5 免疫組織化學示給予3 種不同處理至不同時期SOD1-G93A 小鼠運動皮質與腰髓中SIRT1 表達

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