同工酶分析法鑒定ST細胞系的研究

張敏，陳小云，蔣桃珍，王棟，王磊，王靜文

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

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同工酶分析法鑒定ST細胞系的研究

張敏，陳小云，蔣桃珍，王棟，王磊，王靜文

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

為鑒定ST細胞系的種屬和純凈性，選用乳酸脫氫酶(LD)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和核苷酸磷酸脫氫酶(NP)三種同工酶對ST細胞系進行了同工酶鑒定分析。結果顯示：ST細胞系與豬睪丸原代細胞的三種同工酶譜帶一致，不存在別的雜帶，表明該ST細胞系與豬睪丸原代細胞同種，且不存在其他細胞的交叉污染。本研究可為其他動物源細胞的種屬鑒定和交叉污染檢測提供借鑒。

ST細胞系；同工酶；種屬鑒定；交叉污染

同工酶是具有同一催化作用，但組成、結構及理化性質不同的一組酶，廣泛地存在于高等生物細胞內。同工酶是基因編碼的產物，能較好地反映物種間的遺傳差異，常被用于物種的分類、鑒定和親緣關系研究[1]。不同種屬來源的細胞具有不同的同工酶分布，通過電泳分離可得到它們特異性的同工酶圖譜，因此同工酶檢測可作為種屬鑒別的依據。20世紀60年代，人們即開始將同工酶分析法用于動物細胞種屬的鑒別[2-4],由于當時只選用1～2種同工酶，這些同工酶圖譜在某些種屬關系親近的動物細胞之間差異小，不好區分，而且細胞種屬鑒定一直未引起人們足夠的重視，使此方法未能廣泛被采用。后經反復比較求證，證實在動物細胞鑒定上，選用乳酸脫氫酶(LD)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和核苷酸磷酸脫氫酶(NP)這三種同工酶即可將動物細胞完全鑒定區分開[5]。

ST細胞系是豬瘟病毒等豬源病毒的敏感細胞，常用于豬源病毒的分離培養和體外增殖，近年來被用作豬瘟等疫苗的生產基質發揮了重要作用，其株系特征及純凈性越來越受到人們的重視，但用同工酶分析法鑒定ST細胞的種屬及純凈性還未見報道。本文選用乳酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和核苷酸磷酸脫氫酶三種同工酶，在借鑒其他細胞同工酶分析方法的基礎上，摸索實驗條件，對CVCC細胞庫保存的ST細胞系進行了同工酶分析鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 標準參考細胞株：豬睪丸原代細胞，從1日齡健康仔豬體內分離豬睪丸原代細胞培養，本實驗室自制；內參對照細胞株：小鼠成纖維細胞系(L929)、人宮頸癌細胞系(Hela)，均購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)；樣品細胞：傳代豬睪丸ST細胞系，國家獸醫微生物菌種保藏中心(CVCC)細胞庫保存。

1.1.2 溶液 細胞裂解液：Tris 0.303 g，EDTA 0.0186 g,質量分數2%TritonX-100 50 μL，加水定容至50 mL，HCl調pH至7.5，4 ℃保存。巴比妥緩沖液：巴比妥鈉10.3 g，巴比妥1.84 g，加水定容至1000 mL，4 ℃保存。LD顯色底物：NAD 5 mg，MTT 2 mg，PMS 0.4 mg，1 mol/L乳酸鈉1 mL，0.1 mol/L NaCl 0.5 mL，0.5 mol/L的Tris-Cl(pH8.0)1.5 mL，加水定容至10 mL。G6PD顯色底物：NADP 3 mg，MTT 2 mg，PMS 0.4 mg，G6PD 50 mg，MgCl210 mg,0.5 mol/L的Tris-Cl(pH 8.0)2 mL，加水定容至10 mL。NP顯色底物：肌苷20 mg，MTT 2 mg，PMS 0.4 mg，黃嘌呤氧化酶0.3 unit，0.1 mol/L Na2HPO41 mL，0.5 mol/L Tris-HCl(pH7.5)1 mL，加水定容至10 mL。瓊脂糖凝膠：瓊脂糖0.8 g，EDTA 0.035 g，巴比妥緩沖液100 mL加熱溶化。

1.2 方法

1.2.1 細胞同工酶的提取[6]將豬腎原代細胞、L929、Hela、ST細胞系在T-25培養瓶中培養，當生長至鋪滿瓶底時，吸出培養基。PBS洗細胞單層，加1 mL胰酶置37℃溫箱消化，待細胞脫壁，加2 mL含10%小牛血清的MEM培養基中和胰酶的作用，并將其轉移至無菌離心管，1000 r/min，離心10 min，棄去上清，加1 mL PBS液吹打均勻，快速離心，吸干殘留PBS。估算細胞的體積，加等體積的細胞裂解液置室溫反應2～3 min，冰上反應30 min，4 ℃ 12000 r/min離心5 min，吸出上清移至新的EP管，-20 ℃保存。

1.2.2 瓊脂糖凝膠制備 根據李岑[7]的方法，將2片0.175 mm厚的市售透明膠片夾在兩塊膠槽中間，用文件夾將膠槽和膠片固定在一起。將瓊脂糖凝膠用注射器緩緩從膠槽上的小孔注入膠槽與膠片之間，注入凝膠時注意避免氣泡的產生，并使凝膠均勻的分布在膠片上，待凝固后放4 ℃預冷后使用。

1.2.3 電泳 小心將凝膠剝離膠板，將載有凝膠的膠片放入電泳槽內，然后將細胞裂解上清液用移液槍加到點樣孔中，每孔上樣1～3 μL，靜置30 s使樣品完全被凝膠吸收后，注入電泳液，LD電泳電壓為95 V，電泳時間為1.5 h，G6PD電泳電壓為90 V，電泳時間為1 h，NP電泳電壓為85 V，電泳時間為1 h。為保證同工酶的活性，電泳過程均在冰浴上進行。

1.2.4 顯色 停止電泳后，取出凝膠膠片，放置在暗盒內，注入3～5 mL對應底物的顯色液，37 ℃反應20～25 min，酶譜出現后，在清水中清洗膠片2～3次，用濾紙吸去膠片上的殘留水分即可拍照。

1.2.5 結果判定 顯色后，內參細胞Hela和L929同工酶譜帶與已發表文獻一致，說明電泳條件成立。樣品細胞與標準參考細胞三種同工酶條帶數目均相同，且每一條帶中心位置與上樣孔距離(遷移距離)相同，說明為同一種屬細胞，若無其他雜帶，說明細胞無交叉污染。

2 結果

2.1 乳酸脫氫酶(LD)同工酶電泳試驗 結果如圖1所示。可以看出，Hela細胞的LD同工酶譜條帶數有5條，第一條譜帶在孔的下方，其他四條在孔的上方，L929譜帶有3條，均在孔上方，這與文獻[6]一致，說明電泳條件成立。ST細胞系、豬睪丸原代細胞的LD同工酶譜條帶數也為5條，從遷移距離上看，ST細胞系和豬睪丸原代細胞的5條譜帶均在孔的上方，遷移距離完全一致，且不存在別的雜帶。

1.Hela細胞； 2.L929細胞； 3.豬睪丸原代細胞; 4.ST細胞系圖1 LD同工酶電泳圖

2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)同工酶電泳試驗 結果如圖2所示。可以看出，四種細胞的G6PD同工酶譜條帶數均為一條，但遷移距離卻存在明顯區別，ST細胞系譜帶的遷移距離與豬睪丸原代細胞的距離一致，且不存在別的雜帶。

1.Hela細胞； 2.L929細胞； 3.豬睪丸原代細胞; 4.ST細胞系圖2 G6PD同工酶電泳圖

2.3 核苷酸磷酸脫氫酶(NP)同工酶電泳試驗 結果如圖3所示。可以看出，四種細胞的NP同工酶譜條帶數均為一條，但遷移距離卻存在明顯區別，ST細胞系譜帶的遷移距離與豬睪丸原代細胞的距離一致，且不存在別的雜帶。

1.Hela細胞； 2.L929細胞； 3.豬睪丸原代細胞; 4.ST細胞系圖3 NP同工酶電泳圖

上述三項試驗結果表明，ST細胞系與豬睪丸原代細胞的三種同工酶譜帶完全相同，且條帶中不存在別的雜帶，而與Hela細胞和L929細胞的譜帶存在顯著差異。因此，該ST細胞系應與豬睪丸原代細胞同種，且不存在其他細胞的交叉污染。

3 討論與小結

作為生物學研究與生產的重要原材料，細胞系的株系特性、種屬來源、是否交叉污染等，不僅直接影響到科研數據的可靠性和真實性，更關系到生產產品的質量。據分析，每年約有15%～25%的研究論文因為使用了被錯誤辨識和交叉污染的細胞而獲得錯誤的結論，由此導致數以百萬美元研究經費的浪費。《歐洲藥典》[8]和《中國藥典》[9](2010年版)中已經規定細胞鑒別試驗是必須進行的一項檢驗，而我國獸用生物制品行業對細胞系的純凈性鑒定尚未引起足夠重視。目前國際上對動物細胞系身份識別、交叉污染的主要檢測方法之一是同工酶檢測法，該方法靈敏度較高、結果可靠、時間短，而且只需很少的樣品量即可檢測。

同工酶譜目前還沒有商品化的分子Marker，因此在實驗過程中，我們需要找到一種同源標準細胞株，既可以選用種屬背景清楚的商品細胞株，也可直接選用原代細胞株。本文選用與ST細胞同源的豬原代睪丸細胞作為標準參考細胞株，同時用Hela細胞和L929細胞作為內參對照細胞。

由于同工酶試驗受酶含量、酶活性、電流、電壓、電泳時間、試劑批次、染色的時間影響很大，經常不同批次的試劑就需要重新摸索試驗條件，因此前期試驗條件的摸索需要耗費較長時間。本試驗對提取同工酶的細胞量進行了反復試驗，細胞數太少，所提酶含量就低，電泳顯色后，色帶顏色太淺或無色帶，無法進行結果判斷，反之，酶的量太高，色帶太寬或形成空泡樣，影響結果的判斷。經摸索，LD和NP同工酶細胞數量在106～107/mL左右時，實驗結果最佳；而G6PD同工酶細胞數需達到109/mL才能看見明顯條帶,這與陳麗婷[6]、姜典才[10]的結果相同。其次，本試驗對電泳時間和電壓進行了摸索，電泳時間過短或電壓過低，條帶分離不完全，電泳時間過長或電壓過高，色帶過于分散，而且產熱多也易使不穩定的同工酶失活造成沒有顯帶。我們采用在冰浴中電泳，從而降低電泳過程中溫度，保護了同工酶的活性。

本研究利用三種同工酶成功地對CVCC細胞庫ST細胞系進行了種屬及交叉污染鑒定，可以為其他動物源細胞的種屬鑒定和交叉污染檢測提供借鑒。相信隨著人們對細胞種屬及交叉污染鑒定的日益重視，同工酶分析法將發揮越來越重要的作用。

[1] 朱紅軍,李楊.同工酶技術及其優化[J].生物學通報,2014,49(5): 11-13.

[2] Montes de Oca F,Macy M L,Shannon J E,etal.Isoenzyme characterization of animal cell culture [J].Pro Soc Exp Biol Med,1969,132: 462-469.

[3] Stulberg C S,Peterson W D,Simpson W F.Identification of cells in culture [J].AM J Hematol,1976,1(2): 237-242.

[4] Gail M.Isozyme’s application in speciea identification [J].J Appl Pro,1979,16: 242.

[5] 呂源岡,高效群,張榮興,等.動物細胞株系的質量控制[C].中國細胞生物學學會第五次會議論文摘要匯編,1992:277-278.

[6] 陳麗婷,張雪瑾,沈超,等.實驗細胞資源同功酶分析鑒定[J].氨基酸和生物資源,2006,28(3): 21-24.

[7] 李岑,張國榮.動物細胞同工酶檢測方法的改良及其應用[J].中國醫藥生物技術，2007,2(1): 54-56.

[8] European Pharmacopoeia 7.0[S].530-533.

[9] 國家藥典委員會.中國藥典 二O一O年版[S].15-16.

[10]姜典才,張寧,高光,等.應用同工酶圖譜鑒別動物細胞種屬來源的研究[J].中國生物制品學雜志,1996,9(1): 6-10.

(編輯：李文平)

Identification of ST Cell Line by Isoenzyme Analysis

ZHANG Min，CHEN Xiao-yun，JIANG Tao-zhen，WANG Dong，WANG Lei，WANG Jing-wen

(ChineInstituteofVeterineryDrugControl,Beijing100081,China)

In order to identify the species and purity of ST cell line，three isoenzymes of lactic dehydrogenase(LD),glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) and nucleotide phosphate dehydrogenase(NP) were analysed in this paper.The results showed that the three isoenzymes bands of ST cell line and the swine testicle primary cell culture were consistent,and there is no redundant bands.It indicates that ST cell line and the swine testicle primary cell are the same species,and there is no cross contamination from other species cells.This research provides the reference to other animal origin cells on species identification or cross contamination detection.

ST cell line; isoenzyme; species identification; cross contamination

張敏，碩士，從事動物細胞與病毒學研究。E-mail:zmbooksea@163.com

2015-10-15

A

1002-1280 (2015) 12-0006-04

Q813.1+1