川芎嗪對LPS致傷奶牛子宮內膜上皮細胞的TLR4和BNBD4 mRNA表達的影響

王自力，蔣會會，張翥，魏學良，別應堂，張家驊

(1．西南大學動物科技學院，重慶400715；2．重慶市光大集團有限公司，重慶 400020)

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川芎嗪對LPS致傷奶牛子宮內膜上皮細胞的TLR4和BNBD4 mRNA表達的影響

王自力1，2，蔣會會1，張翥1，魏學良1，別應堂2，張家驊1

(1．西南大學動物科技學院，重慶400715；2．重慶市光大集團有限公司，重慶 400020)

為探討脂多糖(LPS)對奶牛子宮內膜上皮細胞TLR4和BNBD4 mRNA表達的影響及川芎嗪的調控作用，體外培養(yǎng)奶牛子宮內膜上皮細胞，并分為對照組、LPS組、川芎嗪組(高、中、低濃度)，利用實時熒光定量PCR法對各組細胞TLR4和BNBD4 mRNA表達進行了檢測。結果表明：LPS可顯著刺激奶牛子宮內膜上皮細胞TLR4及BNBD4 mRNA表達顯著升高(P<0.05)，川芎嗪可抑制LPS誘導子宮內膜上皮細胞TLR4升高作用，并能促進BNBD4 mRNA表達。提示川芎嗪可干預LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞炎癥反應，并促進其分泌β-防御素起到改善子宮內膜炎的作用。

川芎嗪；脂多糖；子宮內膜上皮細胞；表達

奶牛子宮內膜炎是奶牛產后常見疾病，主要原因是病原微生物如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等感染奶牛子宮內膜，導致奶牛子宮內膜發(fā)生炎性反應，引起子宮內膜充血、炎性物分泌增多，造成繁殖障礙引起經濟損失[1]。研究表明，LPS是大腸桿菌的細胞壁重要組成成分之一，可誘導嚴重的組織炎癥過程；Toll樣受體是介導先天免疫的受體(TLRs)，其中TLR4是介導LPS誘發(fā)和加重組織炎癥反應的重要受體；防御素是一種高效抗菌多肽，可直接殺菌，抵御入侵機體的病原微生物，調節(jié)機體免疫應答、組織創(chuàng)傷修復，在介導獲得性免疫反應過程中起著重要作用，而BNBD4是β-防御素中的重要成員之一[2]。川芎具有活血祛瘀、行氣止痛功效，常用于治療奶牛子宮內膜炎等產科疾病。為了探討其治療奶牛子宮內膜炎的作用機制，本文通過體外培養(yǎng)奶牛子宮內膜上皮細胞，研究川芎的主要有效成分川芎嗪對LPS致傷奶牛子宮內膜上皮細胞的TLT4和BNBD4 mRNA表達的影響，以探討川芎嗪在奶牛子宮內膜炎防治中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 川芎嗪(批號110817-201006)，中國藥品生物制品檢定所；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號1621404)，胎牛血清(批號1315148)，均購自GIBCO公司；LPS(O55:B5)(批號L2880)、青鏈霉素溶液(批號20150513)，DMSO(批號BCBJ4508V)，MTT(批號410C0516)，均購自Sigma公司； TRIZOL(批號A9507-1)、cDNA反轉錄試劑盒(批號AK3101)，購自大連TakaRa公司；SYBRGreen MIX液(批號172-5271)，購自BIO-RAD公司；TLR4、BNBD4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 儀器設備 實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD)，酶標儀(680型，美國BIO-RAD)，臺式高速冷凍離心機(日本HITACHI)，梯度PCR儀(美國Eppendorf)。

1.3 方法

1.3.1 奶牛子宮內膜上皮細胞培養(yǎng) 參照文獻[3]方法培養(yǎng)奶牛子宮內膜上皮細胞。無菌手術采集3歲齡荷斯坦空懷經產奶牛子宮粘膜層，剪成1 mm3大小，于37 ℃0.1%的Ⅱ型膠原酶溶液中振蕩消化40 min后，經過200目細胞篩過濾，濾液經1000 r/min離心5 min后，將所得細胞經RPMI1640完全培養(yǎng)基清洗和懸浮3次，臺盼藍計算細胞活性，培養(yǎng)和純化細胞。

1.3.2 奶牛子宮內膜上皮細胞增殖 采用MTT法檢測奶牛子宮內膜上皮細胞的增殖。將純化后的奶牛子宮內膜上皮細胞用0.5%胰酶消化后，將5×104個/mL的細胞液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分為對照組、川芎嗪組(分別為5、10、20、40 μg/mL濃度組)，每孔100 μL，各組設10個重復，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基。

分別向各孔加入含川芎嗪液，使之終濃度分別為0、5、10、20、40 μg/mL，各孔體積為100 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，加入5 mg/mL 的MTT液20 μL培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基后加入150 μL DMSO震蕩溶解10 min后，于490 nm測定OD值。

1.3.3 奶牛子宮內膜上皮細胞TLR4及BNBD4 mRNA的表達 將純化培養(yǎng)的奶牛子宮內膜上皮細胞調整為5×104個/mL，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)基后，向各孔細胞內加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基，分別向各低、中、高濃度組細胞加入川芎嗪溶液，參照細胞增殖試驗結果，使川芎嗪終濃度分別為5、10、20 μg/mL(簡稱低、中、高劑量組)，對照組和模型組不添加任何藥物，每組5個重復。

各組細胞于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h后，分別向除對照組外的各孔細胞內加入LPS溶液以使終濃度為1 μg/mL，對照組加入相同體積的基礎培養(yǎng)基，于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)上清液， HBSS液沖洗細胞1次后，TRIZOL抽提各孔細胞總RNA，并按照試劑盒說明進行反轉錄，產物保存于-20 ℃條件保存。

1.3.4 引物設計及合成 根據(jù)GenBank中牛TLR4、BNBD4及β-actin基因序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成。各基因引物序列如表1所示。

表1 各基因引物序列表

1.3.5 奶牛子宮內膜上皮細胞中TLR4和BNBD4 mRNA的檢測 提取奶牛子宮內膜上皮細胞的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明，將RNA反轉錄為cDNA后，進行實時熒光定量PCR反應擴增目標基因序列，反應條件為：95 ℃預變性30 min，95 ℃變性5 s，退火(TLR4 56 ℃、BNBD4 54 ℃)30 s，65 ℃延伸5 s，共進行39個循環(huán)，95 ℃延伸30 s。

2 結果與分析

2.1 川芎嗪對奶牛子宮內膜上皮細胞增殖的影響 由圖1可知，分別向奶牛子宮內膜上皮細胞培養(yǎng)基中加入5、10、20、40 μg/mL的川芎嗪，均對各孔奶牛子宮內膜上皮細胞的增殖無顯著影響(P>0.05)。

圖1 川芎嗪對奶牛子宮內膜上皮細胞增殖的影響(n=10)(各組之間相比，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同)

2.2 川芎嗪對奶牛子宮內膜上皮細胞TLR4 mRNA表達的影響 由表2可知，含有1 μg/mL LPS組及低劑量組的奶牛子宮內膜上皮細胞TLR4 mRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05)，而中劑量組、高劑量組細胞TLR4 mRNA表達均顯著低于LPS組及對照組(P<0.05)。

表2 川芎嗪對奶牛子宮內膜上皮細胞TLR4 mRNA表達的影響(n=5)

2.3 川芎嗪對奶牛子宮內膜上皮細胞BNBD4 mRNA表達的影響 由表3可知，LPS組及低劑量組奶牛子宮內膜上皮細胞BNBD4 mRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05)，中劑量組、高劑量組細胞BNBD4 mRNA均顯著低于LPS組及對照組(P<0.05)。

表3 川芎嗪對奶牛子宮內膜上皮細胞BNBD4 mRNA表達的影響(n=5)

3 討論與小結

川芎具有活血行氣、祛風止痛功效，常用于難產、胎衣不下等產科疾病[4]。川芎嗪是傘形科藁本屬植物川芎根提取的生物堿成分，是川芎的主要有效成分之一，常用于防治腦缺血、缺氧再灌注損傷及腦梗死等，具有改善微循環(huán)、抗血栓、改善血液流變學、清除氧自由基、減輕和抑制哮喘的氣道炎癥、抗癌等功效[5]。

本研究表明，5、10、20、40 μg/mL的川芎嗪均對奶牛子宮內膜上皮細胞增殖無明顯影響，即均對奶牛子宮內膜上皮細胞無細胞毒性。因此，本研究選用5、10、20 μg/mL三個濃度的川芎嗪進行后續(xù)研究。同時，本研究表明10、20 μg/mL的川芎嗪可顯著抑制奶牛子宮內膜上皮細胞TLR4 mRNA的表達，可抑制LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞炎性反應的發(fā)生，且5、10、20 μg/mL的川芎嗪均能顯著促進奶牛子宮內膜上皮細胞BNBD4 mRNA 的表達(P<0.05)?，F(xiàn)有研究表明，川芎嗪治療急性冠狀動脈綜合征中具有抗炎及促纖溶作用，可有效降低血漿C反應蛋白、血清淀粉樣蛋白及纖溶酶原抑制劑-1的濃度[6]。

研究表明，TLR4可識別病原體，可向胞內傳遞信號激活NF-κB和AP-1等轉錄因子而促使細胞啟動一系列免疫炎癥反應，清除入侵的病原微生物，例如產生許多可擴大免疫炎癥反應、增強殺菌作用的細胞因子IL-1，IL-6，IL-8，IL-12及TNF-α等引發(fā)和加重炎癥反應[7]。現(xiàn)有研究表明，川芎嗪能抑制大鼠動脈粥樣硬化形成中TLR4表達而達到抗炎以及動脈粥樣硬化的功效[8]。因此，結合本研究結果可知，川芎嗪可通過干預子宮內膜上皮細胞TLR4 受體的表達，進而控制TLR4下游的炎性信號通路及炎性細胞因子的表達和分泌，參與控制局部炎癥反應，起到防治子宮內膜炎的作用。

由本研究可知，LPS可誘導奶牛子宮內膜上皮細胞BNBD4 mRNA的表達增加，川芎嗪可進一步促使BNBD4的表達，而BNBD4是β-防御素的重要成員之一。研究表明，β-防御素可由皮膚、黏膜、氣道等上皮細胞產生，分布在宿主機體與環(huán)境的界面位置，構成機體抵御細菌、炎性細胞因子等侵襲的第一道化學屏障，其功能的失活與病原微生物定植、集落于皮膚和黏膜上皮而導致嚴重的感染關系非常密切[9]，對保護上皮細胞和黏膜免受感染起著屏障防御的作用[10]，且對G+、G-、包膜病毒和真菌均具有強烈的殺傷作用，且對動物組織細胞無殺傷作用[11-12]。

綜上所述，川芎嗪具有控制LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞炎性反應的作用，并能促進奶牛子宮內膜上皮細胞分泌β-防御素，起到控制子宮內膜炎癥的作用，初步闡釋了川芎在奶牛子宮內膜炎中的作用效果及可能機制，但其分子信號機制尚需進一步研究。

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(編輯：侯向輝)

Effects ofLigustrazineon TLR4 and BNBD4 mRNA Expression Level of Endometrial Epithelial Cells in Cow Injured with LPS

WANG Zi-li1,2,JIANG Hui-hui1,ZHANG Zhu1,WEI Xue-liang1,BIE Ying-tang2,ZHANG Jia-hua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400715，China; 2.ChongqingGondaGroupCo.,Ltd,Chongqing400020，China)

In order to investigate the effects ofLigustrazineon the TLR4 and BNBD4 mRNA expression level of endometrial epithelial cells in cow injured with LPS,the endometrial epithelial cells are cultured in vitro,and then be divided into 3 groups: control group,LPS group,Ligustrazinegroup.And then the TLR4 and BNBD4 mRNA expression level in bovine endometrial epithelial cells were menstruated with real-time PCR.The results show that the LPS could raise the TLR4 and BNBD4 mRNA expression level in bovine endometrial epithelial cells in significantly,while theLigustrazinecould decrease the TLR4 mRNA expression level and increase the BNBD4 mRNA expression level in bovine endometrial epithelial cells in significantly.Therefore,Ligustrazinecould control the inflammatory reaction caused by LPS in bovine endometrial epithelial cells throughdecreasing the TLR4 mRNA expressing level and increasing the β- defensin’s expression.

Ligustrazine；LPS；endometrial epithelial cells；expression

重慶市應用開發(fā)計劃項目(cstc2014yykfB10001)；重慶市博士后特別資助項目(XM20120050)；中央高?；緲I(yè)務經費(XDJK2016C098)

王自力，博士，副教授，從事中獸醫(yī)學及中藥免疫藥理學研究。

2015-11-12

A

1002-1280 (2015) 12-0032-04

S853.72