膜分離法純化濃縮的豬細(xì)小病毒滅活疫苗效果研究

武桂梅，王振輝*，何玉友，李鵬，鄭洪娟

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林132101； 2.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林132101)

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膜分離法純化濃縮的豬細(xì)小病毒滅活疫苗效果研究

武桂梅1，王振輝1*，何玉友2，李鵬1，鄭洪娟2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林132101； 2.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林132101)

為了研究純化濃縮的豬細(xì)小病毒滅活疫苗的免疫效果，應(yīng)用微濾/超濾管式陶瓷膜分離系統(tǒng)對(duì)豬細(xì)小病毒細(xì)胞收獲液進(jìn)行純化濃縮，使?jié)饪s液病毒平均含量由104.7TCID50/mL提高到106.5TCID50/mL；將純化濃縮的病毒液經(jīng)檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行甲醛滅活，與注射用礦物白油佐劑制成油包水滅活疫苗；按照豬細(xì)小病毒滅活疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)制備的滅活疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)與免疫效果試驗(yàn)。結(jié)果顯示：純化濃縮的豬細(xì)小病毒液雜蛋白去除率平均達(dá)到71.6%左右；制備的三組滅活疫苗檢驗(yàn)均合格；免疫至63 d時(shí)，免疫豬體內(nèi)抗豬細(xì)小病毒抗體(HI)水平分別為：純化濃縮的滅活疫苗平均高達(dá)9.62 log2稀釋倍數(shù)，常規(guī)疫苗平均為8.78 log2稀釋倍數(shù)，差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)表明：疫苗病毒細(xì)胞收獲液進(jìn)行膜純化技術(shù)處理后，免疫效果顯著優(yōu)于未經(jīng)純化的常規(guī)滅活疫苗。

豬細(xì)小病毒；純化濃縮；滅活疫苗；免疫效果

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔及母豬不育和新生仔豬大量死亡，疫苗接種是控制PPV感染的最有效措施[1]。張超范等研究豬細(xì)小病毒滅活疫苗發(fā)現(xiàn)病毒含量與疫苗的免疫效果密切相關(guān)，且最大程度降低犢牛血清含量來(lái)減少滅活疫苗的副反應(yīng)[2-3]。目前，國(guó)內(nèi)獸醫(yī)生物制品行業(yè)制備動(dòng)物疫苗的病毒細(xì)胞收獲液基本是未經(jīng)純化的，含有大量與免疫無(wú)關(guān)的非特異蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致一些畜禽個(gè)體免疫麻痹或失敗[4]。國(guó)內(nèi)關(guān)于豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效果的研究較多，但有關(guān)對(duì)豬細(xì)小病毒進(jìn)行純化濃縮的研究很少。為了探索純化濃縮的病毒滅活疫苗免疫效果，應(yīng)用膜分離技術(shù)[5]對(duì)某生物制品廠提供的病毒含量低的豬細(xì)小病毒細(xì)胞收獲液進(jìn)行雜蛋白濾除，并制成油乳劑滅活疫苗進(jìn)行了免疫效果試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 微濾/超濾管式陶瓷膜分離系統(tǒng) 型號(hào)：SY-MU-2-500,管式陶瓷膜元件孔徑1.0 μm、0.80 μm、0.60 μm、0.22 μm，管式有機(jī)膜元件(改良纖維素)5K， 由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 豬細(xì)小病毒細(xì)胞收獲液 吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供120000 mL(病毒含量為104.7TCID50/mL)，國(guó)內(nèi)三家獸醫(yī)生物制品廠生產(chǎn)的未純化的常規(guī)豬細(xì)小病毒滅活疫苗(各500頭份，編號(hào)：對(duì)照01、對(duì)照02與對(duì)照03)。

1.3 細(xì)胞與試劑 仔豬腎傳代細(xì)胞(IBRS-2)，豬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(批號(hào)20110901)、豬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(批號(hào)20110707)均由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 4日齡同窩乳鼠、350～400 g的豚鼠均由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供；2月齡仔豬(豬瘟中和抗體陰性、豬細(xì)小病毒HI抗體效價(jià)≤3 Log2)由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)習(xí)豬場(chǎng)提供。

1.5 不同膜組合對(duì)豬細(xì)小病毒收獲液的純化與濃縮 分三組進(jìn)行：1組(1.0 μm、5K、0.22 μm)陶瓷膜過(guò)濾；2組(0.80 μm、5 K、0.22 μm)陶瓷膜過(guò)濾；3組(0.60 μm、5K、0.22 μm)陶瓷膜過(guò)濾。先分別用1.0 μm、0.80 μm、0.60 μm陶瓷膜過(guò)濾雜蛋白，再用5K陶瓷膜濃縮病毒，最后用0.22 μm除菌處理。每組膜純化濃縮處理40 000 mL未處理的豬細(xì)小病毒滅活液，

1.6 病毒含量測(cè)定、雜蛋白去除率、病毒滅活與無(wú)菌檢驗(yàn)

1.6.1 病毒含量測(cè)定 用DMEM培養(yǎng)液將純化濃縮前后的豬細(xì)小病毒細(xì)胞收獲液作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個(gè)稀釋度，分別接種于已生長(zhǎng)良好的單層IBRS-2細(xì)胞的96孔細(xì)胞微量培養(yǎng)板，每個(gè)滴度接種5孔，每孔100 μL，置37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～120 h，每日觀察并記錄細(xì)胞病變，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量(TCID50/mL)。

1.6.2 雜蛋白去除率、病毒滅活與無(wú)菌檢驗(yàn) 三組純化濃縮前后的豬細(xì)小病毒液分別用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總蛋白含量，計(jì)算雜蛋白去除率[6]；病毒滅活檢驗(yàn)，將純化濃縮滅活的病毒原液分別接種于已生長(zhǎng)良好的單層IBRS-2細(xì)胞的96孔細(xì)胞微量培養(yǎng)板，每個(gè)樣品接種10孔，每孔100 μL，置37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～120 h，每日觀察并記錄細(xì)胞病變；純化后滅活病毒液分別用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(TG)、酪胨瓊脂培養(yǎng)基(GA)、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(GP)按《中華人民共和國(guó)獸藥典》[7]的方法進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

1.7 純化濃縮的豬細(xì)小病毒滅活疫苗制備 三組純化濃縮的滅活病毒液各取1500 mL制備5000 mL滅活疫苗。其中油相制備、水相制備、乳化、黏度檢驗(yàn)、分裝按文獻(xiàn)方法[5]進(jìn)行制備。

1.8 純化濃縮的豬細(xì)小病毒滅活疫苗檢驗(yàn) 按《中華人民共和國(guó)獸藥典》[7]進(jìn)行黏度、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)。

1.9 純化濃縮的豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫試驗(yàn)

1.9.1 仔豬分組與免疫 根據(jù)試驗(yàn)內(nèi)容，選用2月齡斷奶仔豬60頭(母原抗體平均≤4 Log2)，隨機(jī)平均分為6組。第1、2、3組每頭仔豬對(duì)應(yīng)接種三組純化濃縮的豬細(xì)小病毒滅活疫苗2 mL；第4、5、6組為未純化的滅活疫苗免疫對(duì)照組，每頭仔豬接種常規(guī)豬細(xì)小病毒滅活疫苗2 mL。

1.9.2 抗體中和效價(jià)測(cè)定 分別于免疫后第0、7、14、21、28、35、42、49、63 d對(duì)6組試驗(yàn)豬耳靜脈無(wú)菌采血，分離血清滅活后，分別用豬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、豬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)的豬細(xì)小病毒病毒抗原，用1%健康豚鼠的紅細(xì)胞懸液進(jìn)行HI血凝抑制試驗(yàn)[8-9]，測(cè)定抗體HI效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒含量、雜蛋白去除率、病毒滅活與無(wú)菌檢驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表1。由于三組微孔陶瓷膜的孔徑分別是1.0 μm、0.8 μm、0.6 μm，所以三組純化濃縮病毒含量顯著提高，平均病毒含量達(dá)到106.5TCID50/mL；病毒收獲量由高到低，蛋白質(zhì)去除率由低到高，三組平均雜蛋白去除率為71.6%。三組純化濃縮的病毒液濃縮倍數(shù)均高達(dá)10以上，滅活與無(wú)菌檢驗(yàn)均合格。

表1 病毒含量、雜蛋白去除率、滅活與無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

蛋白去除率=(純化前蛋白質(zhì)含量×純化前投入量-純化后蛋白質(zhì)含量×純化后收獲量)÷(純化前蛋白質(zhì)含量×純化前投入量)×100%

2.2 純化濃縮的滅活疫苗檢驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表2。三組滅活疫苗由于純化濃縮平均去除雜蛋白達(dá)到71.6%，大大減少雜蛋白對(duì)安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)的影響，達(dá)到檢驗(yàn)一次通過(guò)率，全部合格。

表2 純化濃縮的豬細(xì)小病毒滅活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 純化濃縮的滅活疫苗與未純化的滅活疫苗免疫豬血清HI檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表3。免疫28 d時(shí)，純化濃縮的滅活疫苗和未純化的對(duì)照滅活疫苗血清抗體平均升至最高，純化的三組滅活疫苗血清抗體消長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)，抗體效價(jià)平均為10.80 log2稀釋倍數(shù)；未純化的對(duì)照三組滅活疫苗血清抗體消長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)，平均為9.90 log2稀釋倍數(shù)；純化的滅活疫苗比未純化的對(duì)照滅活疫苗血清抗體消長(zhǎng)差異顯著(P<0.05)。免疫63 d時(shí)，純化的三組滅活疫苗血清抗體平均消長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)，平均為9.62 log2稀釋倍數(shù)；而未純化的對(duì)照滅活疫苗血清抗體消長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)，平均為8.78 log2稀釋倍數(shù)；純化的滅活疫苗比對(duì)照滅活疫苗血清抗體消長(zhǎng)差異極顯著(P<0.05)。

表3 不同免疫時(shí)間純化組與未純化組滅活疫苗豬血清HI抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果 log2

同列肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

通過(guò)使用1.0 μm、0.80 μm、0.60 μm三種微孔陶瓷膜過(guò)濾，首先濾除病毒液中細(xì)胞碎片、犢牛血清中與免疫無(wú)關(guān)的雜蛋白，然后使用5K的改良纖維素超濾膜濾除病毒液中多余的水分子，使病毒液得到純化濃縮，顯著提高了病毒含量，最后使用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行除菌處理，避免了雜蛋白、細(xì)菌及其毒素對(duì)疫苗病毒抗原的免疫效果影響。

通過(guò)微濾、超濾、除菌處理使含毒病毒液濃縮倍數(shù)達(dá)到10倍之多，病毒平均含量由最初的104.7TCID50/mL提高到106.5TCID50/mL，雜蛋白去除率平均達(dá)到71.6%左右。由于三組微孔膜差異小，故純化濃縮后三組之間檢測(cè)數(shù)據(jù)差異不顯著。三組純化濃縮的病毒液制備的滅活疫苗的各項(xiàng)檢驗(yàn)均一次檢驗(yàn)合格，較某生物制品廠同類產(chǎn)品復(fù)檢合格比較，說(shuō)明雜質(zhì)含量與疫苗質(zhì)量關(guān)系密切。純化濃縮的滅活疫苗與對(duì)照常規(guī)滅活疫苗免疫豬血清抗體效價(jià)數(shù)據(jù)分析，不同免疫日齡檢測(cè)抗體水平數(shù)據(jù)表明：純化的疫苗抗體數(shù)值顯著高于未純化的常規(guī)疫苗。

目前，為了提高疫苗的抗原蛋白含量，多數(shù)獸醫(yī)生物制品廠家應(yīng)用頗爾過(guò)濾器(PALL)對(duì)病毒細(xì)胞收獲液或組織收獲液進(jìn)行超濾濃縮除去多余的水分子等低分子物質(zhì)，但該設(shè)備只能濃縮，不能截留除去細(xì)胞膜碎片等大分子雜蛋白，提高了病毒含量的同時(shí)也提高了雜質(zhì)的含量，增加了對(duì)疫苗免疫的影響因素。目前，國(guó)內(nèi)膜的種類功能繁多、膜分離設(shè)備有開(kāi)放式和密閉循環(huán)式多種，非常適合細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、酶的分離純化濃縮。

由于對(duì)病毒的純化濃縮，增加了生產(chǎn)成本，而且膜分離設(shè)備和膜價(jià)格較高且操作具有一定的技術(shù)難度，所以未被獸醫(yī)生物制品行業(yè)廣泛開(kāi)發(fā)研究利用。但人用疫苗的病毒和細(xì)菌培養(yǎng)物都是經(jīng)過(guò)純化的，基本沒(méi)有副反應(yīng)。所有病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)、酶、核酸的純化濃縮工藝中膜分離技術(shù)是最快捷、回收率最高的[10]。本試驗(yàn)處理的病毒液是某獸醫(yī)生物生物制品廠檢驗(yàn)病毒含量低不能用于制備疫苗的，試驗(yàn)結(jié)果表明，膜分離技術(shù)非常適合報(bào)廢的病毒液或滅活的病毒液純化濃縮，做到廢物回收利用，降低了生產(chǎn)成本，提高了疫苗的質(zhì)量。膜分離注意事項(xiàng)是膜的孔徑要比目的物的分子量大10倍左右，如果純化的是活病毒盡量不用除菌處理，以免滅活病毒，循環(huán)流量和循環(huán)壓力[10]盡可能低一些，避免生物活性被破壞。本試驗(yàn)是分段間歇性處理病毒液，下一步將研究密閉可循環(huán)式的串濾膜分離操作，達(dá)到一次產(chǎn)出合格的產(chǎn)品，提高收率和質(zhì)量。

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[2] 張超范,崔尚金,苗嵐飛,等.豬細(xì)小病毒滅活疫苗安全性試驗(yàn)及佐劑的篩選[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31 (6):462-465.

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(編輯：李文平)

Research on the Effect of Purified and Concentrated Porcine Parvovirus Inactivated Vaccine by Membrane Separation

WU Gui-mei1, WANG Zhen-hui1*, HE Yu-you2, LI Peng1, ZHENG Hong-juan2

(1.JilinAgriculturalScienceandTechnologyCollege,Jilin132101,China;2.JilinZhengYeBiologicalProductsCo.Ltd.,Jilin132101,China)

This research aims to test the immune effect of the purified and concentrated porcine parvovirus inactivated vaccine.The average amount of the porcine parvovirus was increased from 104.7TCID50/mL to 106.5TCID50/mL by applying the microfiltration/ultrafiltration tubular ceramic membrane system to purify and concentrate the porcine parvovirus vaccine cells liquid.Next, the purified concentrated porcine parvovirus virus was inactivated by formaldehyde and passed the test.Then it was used to produce the water-in-oil inactivated vaccines along with the injectable mineral white oil.In accordance with the quality standard of viral inactivation vaccine for Porcine Parvovirus, the immune effect tests have been done.The result show that: the removal rate of impure protein in porcine parvovirus virus liquid is about 71.6%.All three groups of the produced inactivated vaccine meet the standard.After 63 days immunization, the porcine parvovirus antibody level (HI) in immunized pigs is: 9.62 log2dilution ratio in average for purified and concentrated inactivated vaccine and 8.78 log2dilution ratio for conventional vaccines respectively.The difference is significant(P<0.05).The test shows that: the immune effect of inactivated vaccine with inactivated virus liquid membrane purification process was significantly better than the normal vaccines without the purification.

porcine parvovirus virus; purified and concentrated; inactivated vaccine; immune effect

吉林省教育廳“十一五”科研項(xiàng)目(吉教科合字[2008]第245號(hào))

武桂梅，實(shí)驗(yàn)師，從事獸醫(yī)生物制品實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究。

王振輝。E-mail:yaowu108@sohu.com

2015-08-13

A

1002-1280 (2015) 11-0049-04

S858.28