直腸黏液腺癌組織中四種耐藥基因蛋白的表達變化及意義

楊成萬，陶明珠，龍漢安(瀘州醫學院附屬醫院，四川瀘州 646000)

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直腸黏液腺癌組織中四種耐藥基因蛋白的表達變化及意義

楊成萬，陶明珠，龍漢安(瀘州醫學院附屬醫院，四川瀘州 646000)

摘要：目的觀察直腸黏液腺癌(MUC)組織中多藥耐藥基因p-糖蛋白(p-gp)、胸苷酸合酶(TS)、谷胱甘肽轉移酶-π(GST-π)、DNA拓撲異構酶(TopoⅡ)的表達變化，并探討其意義。方法應用免疫組化SP法對37例直腸黏液腺癌及261例直腸非黏液腺癌(non-MUC)組織中p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白進行檢測，并分析其與MUC臨床病理參數的關系。結果直腸黏液腺癌與非黏液腺癌組織中p-gp陽性表達率分別為81.1%、94.5%，TS陽性表達率分別為83.8%、72.0%，GST-π陽性表達率分別為51.4%、73.9%，TopoⅡ陽性表達率分別為62.2%、71.6%，直腸黏液腺癌與非黏液腺癌組織中p-gp、GST-π陽性表達率比較，P均<0.01。GST-π與直腸黏液腺癌分化程度有關，高中分化者GST-π陽性表達率明顯高于低分化者(P<0.01)，p-gp、TS、TopoⅡ表達與直腸黏液腺癌臨床病理參數間無相關性。p-gp與TS表達呈正相關(r=0.349，P<0.05)。結論直腸黏液腺癌組織中TS表達升高，p-gp、GST-π、TopoⅡ表達降低，GST-π表達與直腸黏液腺癌分化程度有關；四種耐藥基因蛋白聯合檢測可為直腸黏液腺癌化療藥物的篩選及個體化治療方案制定提供依據。

關鍵詞：直腸腫瘤；黏液腺癌；p-糖蛋白；谷胱甘肽轉移酶；DNA拓撲異構酶；胸苷酸合酶；多藥耐藥

大腸黏液腺癌是大腸癌的一種特殊類型，占大腸癌患者的1.6%～25.4%[1，2]，主要治療手段是手術切除結合化療的綜合治療模式。直腸黏液腺癌可切除率低，易對化療藥物耐藥，治療效果不佳。明確相關耐藥基因產物在直腸黏液腺癌組織中的表達特點對了解直腸黏液腺癌的生物學特性、指導患者個性化治療有重要意義[3]。本研究觀察了直腸黏液腺癌組織中耐藥基因蛋白p-糖蛋白(p-gp)、谷胱甘肽轉移酶-π(GST-π)、DNA拓撲異構酶(Topo Ⅱ)、胸苷酸合酶(TS)表達變化，并探討其意義。現將結果報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料2010年1月～2013年10月就診于瀘州醫學院附屬醫院的直腸癌患者298例，男179例、女119例，平均年齡62.35歲。術前均未行放療、化療等治療。依據WHO黏液腺癌的判定標準[4]進行分類，黏液腺癌(黏液樣物質占腫瘤體積的50.0%以上)37例，非黏液腺癌261例。298例均經手術治療并留取腫瘤組織。

1.2p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ檢測方法所有標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，進行連續切片，采用免疫組化SP法進行染色。按試劑盒說明書進行操作，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照，以各自已知陽性切片作為陽性對照。p-gp陽性表達于細胞膜和細胞質，TS和 GST-π陽性表達于細胞質，TopoⅡ陽性表達于細胞核。相應部位出現棕黃色顆粒即判為陽性表達。p-gp、TS和GST-π陽性強度以+表示，隨機計數10個高倍視野，統計陽性細胞數，陽性細胞數<10%為(-)，10%～25%為(+)，26%～75%為(++)，≥75%為(+++)。TopoⅡ陽性標準以級別表示，陽性細胞數<25%為Ⅰ級，26%～50%為Ⅱ級，51%～75%為Ⅲ級，>75%為Ⅳ級。(-)和(+)或Ⅰ級視為陰性，≥(++)或Ⅱ級視為陽性，p-gp、TS、GST-π≥(++)、TopoⅡ≤Ⅰ級具有診斷意義，表明腫瘤具有多藥耐藥性[5，6]。

1.3統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，采用Pearson相關分析法對p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白表達進行相關性分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2結果

直腸黏液腺癌與非黏液腺癌組織中p-gp陽性表達率分別為81.1%、94.5%，TS陽性表達率分別為83.8%、72%，GST-π陽性表達率分別為51.4%、73.9%，Topo Ⅱ陽性表達率分別為62.2%、71.6%，直腸黏液腺癌與非黏液腺癌組織中p-gp、GST-π陽性表達率比較，P均<0.01。GST-π與直腸黏液腺癌分化程度有關，高中分化者GST-π陽性表達率明顯高于低分化者(P<0.01)；p-gp、TS、Topo Ⅱ在直腸黏液腺癌組織中的表達與臨床病理參數間無明顯相關性(P>0.05),見表1。p-gp與TS呈正相關(r=0.349，P<0.05)，而其余指標間無明顯相關性。

表1　p-gp、TS、GST-π、TopoⅡ蛋白表達與直腸黏液腺癌臨床病理參數的關系(例)

3討論

黏液腺癌是直腸癌的特殊類型，可切除率低，選擇敏感的化療藥物對術后化療有重要意義。腫瘤多藥耐藥是導致腫瘤化療失敗的重要原因。目前已發現，p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ在多種腫瘤耐藥性上發揮重要作用，但對直腸黏液腺癌同時檢測上述4種蛋白表達及其意義的研究尚未見報道。

p-gp是由7號染色體上的多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的跨膜糖蛋白，為一種ATP依賴性跨膜轉運泵，其跨膜結構具有能量依賴性“藥物泵”功能，能將細胞內帶陽性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細胞外，使細胞內化療藥物達不到有效作用濃度從而產生耐藥性[7]。因而p-gp的表達水平與耐藥程度呈正比。其所介導的抗癌藥物主要為植物堿類、阿霉素、紫杉醇和泰素帝等。本研究直腸黏液腺癌組織中p-gp陽性表達率率為81.1%,明顯低于非黏液腺癌，說明直腸黏液腺癌對植物堿類、阿霉素等藥物化療較非黏液腺癌相對敏感。直腸黏液腺癌p-gp表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移、臨床分期等無相關性，說明直腸黏液腺癌在p-gp介導的多藥耐藥機制上不同于其他大腸癌。

GST是一組具有解毒和結合蛋白質功能的同工酶，與多藥耐藥相關的有GST-α、GST-μ和GST-π。其中GST-π是腫瘤細胞和組織中最常見且與腫瘤耐藥關系最密切的一種亞型，其能催化親電子物質與GST結合，并與親脂性細胞毒藥物結合增加其水溶性，促進藥物代謝，從而降低抗癌藥物的細胞毒作用。其過度表達與順鉑、氮芥、環磷酰胺、瘤可寧和阿霉素耐藥有關。本研究直腸黏液腺癌組織中GST-π陽性表達率明顯低于直腸非黏液腺癌，說明直腸黏液腺癌對順鉑、氮芥等化療藥物較非黏液腺癌相對敏感，GST-π陽性表達與黏液腺癌分化程度呈正相關。

TS是胸苷酸合成的限速酶，其功能是催化尿嘧啶脫氧核苷(dUMP)甲基化為胸腺嘧啶脫氧核苷(dTMP)，此步驟為DNA生物合成所必須，故TS被抑制，將抑制DNA合成進而抑制細胞的生長和增殖。研究表明TS與腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性呈明顯負相關，當TS過度表達時，不能徹底阻斷TS，將導致腫瘤細胞對5-FU耐藥，低表達的TS預示著腫瘤細胞對5-FU較好的敏感性[8，9]。本研究顯示，直腸黏液腺癌TS陽性表達率與非黏液腺癌無顯著性差異，均對5-FU有較高的耐藥性，進行TS檢測將有助于確定是否選用5-FU化療。TS表達與p-gp呈明顯正相關，提示二者在直腸黏液腺癌的多藥耐藥發生機制中可能發揮某種協同作用。

TopoⅡ是DNA復制必需的酶，催化單鏈或是雙鏈DNA斷裂，促進DNA復制。當基因發生突變時，抗癌藥物不能與其結合，產生細胞耐藥。以TopoⅡ為靶點的藥物主要為蒽環類抗生素和鬼臼霉素類如VP16、替尼泊苷、玫瑰樹堿、新霉素和阿霉素等。本研究結果顯示，直腸黏液腺癌TopoⅡ陽性率與非黏液腺癌無明顯差異，且與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期等無明顯關系。與王恒樹等[10]對大腸癌的研究結果不同，后者發現大腸癌TopoⅡ表達與分化程度、臨床分期呈正相關，與淋巴結轉移呈負相關。說明直腸黏液腺癌在TopoⅡ介導的多藥耐藥機制上不同于其他大腸癌。

本研究結果顯示，p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ在直腸黏液腺癌組織中均有表達，且直腸黏液腺癌組織中p-gp、GST-π陽性表達率明顯低于非黏液腺癌，而GST-π與直腸黏液腺癌分化程度有關，高中分化者GST-π陽性表達率明顯高于低分化者。本組直腸黏液腺癌p-gp與TS共表達率高達73.0%，而相關分析結果顯示p-gp與TS呈正相關，提示二者可能存在相互調節機制。可見直腸黏液腺癌多藥耐藥機制是多基因、多途徑共同參與的結果，聯合檢測p-gp、TS、GST-π和TopoⅡ可為直腸黏液腺癌化療藥物的篩選及個體化治療方案制定提供重要依據。

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Significance of expression of 4 drug resistant gene proteins p-gp, TS, GST-π

and TopoⅡin mucousadenocarcinoma of the rectum

YANGCheng-wan，TAOMing-zhu，LONGHan-an

(TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the change of expression of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡ in mucousadenocarcinoma(MUC) of the rectum, and investigate its significance. Methods The expression of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡ in 37 cases of MUC and 261 cases of non- mucousadenocarcinoma (non-MUC) of the rectum was detected by using immunohistochemical SP method．ResultsThe positive expression rate of p-gp in MUC and non-MUC was 81.1% and 94.5%，respectively. The positive rate of TS was 83.8% and 72.0%, the positive rate of GST-π was 51.4% and 73.9%, and the positive rate of TopoⅡwas 62.2% and 71.6%. The positive expression rate of p-gp and GST-π in MUC was significantly lower than that in non-MUC (P<0.01). The expression of GST-π was correlated with tumor degree of differentiation, and the positive rate of GST-π in well or moderately differentiated MUC was significantly higher than that in poorly differentiated MUC (P<0.01). The expression of p-gp, TS and TopoⅡ was not correlated with clinical and pathological features of MUC. P-gp expression was positively correlated to TS expression (P<0.05). ConclusionThe expression of TS is heightened and the expression of p-gp, GST-π and TopoⅡ is degraded in MUC of the rectum. The expression of GST-π is correlated with tumor degree of differentiation．The joint detection of p-gp, TS, GST-π and TopoⅡwill be useful for choosing sensitive chemotherapeutic drugs and selecting individual therapeutic regimen in rectum MUC treatment.

Key words:rectum； mucousadenocarcinoma； p- glycoprotein； Thymidylate synthase； glutathione transferase-π；topoisomeraseⅡ； multidrug resistance

(收稿日期：2014-10-11)

通信作者簡介：龍漢安(1964-)，男，碩士，教授，主要研究方向為腫瘤病理。Email：longhanan@qq.com

作者簡介：第一楊成萬(1969-)，男，碩士，副教授，主要研究方向為腫瘤病理。E-mail:ycwty@163.com

基金項目：四川省應用基礎研究計劃項目(14JC0039)。

中圖分類號：R735.37

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)03-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.002