腎臟纖維化大鼠外周血纖維細胞計數變化及意義

黨艷梅，李新建，張少青，曲小菡，魏明明，張昆(濟寧醫學院附屬醫院，山東濟寧272029)

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腎臟纖維化大鼠外周血纖維細胞計數變化及意義

黨艷梅，李新建，張少青，曲小菡，魏明明，張昆(濟寧醫學院附屬醫院，山東濟寧272029)

摘要：目的通過流式細胞儀對5/6腎切除大鼠外周血中的纖維細胞計數變化，觀察外周血纖維細胞數量與腎臟纖維化程度之間的關系，探討外周血纖維細胞作為腎纖維化早期生物學標志物的可行性。方法清潔級雄性SD大鼠10只，隨機分為對照組(n=4)和模型組(n=6)。模型組5/6腎切除制作腎臟纖維化模型，對照組只剝離腎包膜，不切除腎實質。以CD45和Ⅰ型膠原作為循環纖維細胞的表面標記，使用流式細胞儀對兩組大鼠外周血纖維細胞計數；結合腎功能生化指標及腎臟病理學改變，分析循環纖維細胞計數在腎纖維化中的意義。結果造模后第4、8、12周，模型組腎小球積分、腎小管間質積分、血清肌酐、尿素氮均高于對照組(P均<0.01)。模型組在造模后的第4、8、12周，外周血纖維細胞計數顯著升高，高于對照組(P均<0.01)。外周血纖維細胞計數與血清肌酐、尿素氮呈正相關(r分別為0.623、0.550，P均<0.05)。結論外周血纖維細胞計數在腎纖維化早期與腎臟病理改變一致，可早期預示腎纖維化的發展進程。

關鍵詞：循環纖維細胞；慢性腎功能衰竭；腎臟纖維化；大鼠

研究表明，纖維細胞參與了多個臟器的纖維化，介導諸如腎纖維化、肺臟纖維化、支氣管哮喘、皮膚創傷以及內膜增生等多種病理過程[1～5]。研究和尋找防治腎纖維化的新靶標以及給予適時治療方略對進一步改善慢性腎臟病(CKD)的預后至關重要。因此，我們通過對外周血纖維細胞計數，觀察循環中纖維細胞數量與腎臟纖維化之間的關系，探討外周血循環纖維細胞作為腎纖維化早期生物學標志物的可行性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物6～8周齡，體質量(200±20)g清潔級雄性SD大鼠10只，隨機分為對照組(n=4)和模型組(n=6)。

1.1.2設備與試劑抗CD45-PE抗體(554878，BD)，兔多克隆Ⅰ型膠原抗體(ab292，Abcam)，FITC標記的山羊抗兔抗體(A0562，碧云天)，淋巴細胞分離液(BV903200，上海拜沃)；DMEM培養液(11965-092，Gibco)；BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀。

1.2方法

1.2.1腎臟纖維化模型制備方法用10%水合氯醛腹腔麻醉，行左背旁正中縱切口，暴露左側腎臟，分離腎包膜，夾閉左腎蒂，剪掉左腎上下各1/3腎實質，明膠海綿止血后殘腎還納入腹腔，逐層縫合，消毒。1周后切去右腎，即制備成5/6腎切除殘腎模型。對照組只剝離腎包膜，不切除腎實質。

1.2.2標本的留取方法對照組和模型組大鼠分別在手術后第4、8、12周留取外周血進行生化指標的檢測，留取腎臟組織標本用于腎臟病理染色。同時留取部分抗凝血進行纖維細胞計數的前期處理：肝素抗凝全血1 mL與等體積生理鹽水混合，緩慢加入含2 mL淋巴細胞分離液的離心管中，保持兩液面分界清晰，室溫下離心2 000 r/min×20 min。離心后，管內液體分為3層，吸取中間淋巴細胞層約2 mL移入新的離心管中，加入10 mL生理鹽水，混勻后離心1 000 r/min×10 min。棄上清，加入1 mL細胞凍存液重懸細胞沉淀，轉移至1.5 mL無菌凍存管中，-80 ℃凍存1 d再轉入液氮中保存，在標本收集完成后統一檢測。

1.2.3外周血纖維細胞計數方法取出凍存的白細胞樣本在37 ℃水浴中快速復融，1 500 r/min離心5 min，使用生理鹽水洗滌1次，并用預冷的生理鹽水重懸細胞沉淀并分裝至1.5 mL EP管中。加入抗大鼠CD45-PE抗體，室溫孵育30 min。細胞經過透化處理后加入100 μL生理鹽水洗滌2次。然后分別加入兔抗大鼠Col Ⅰ抗體，室溫孵育30 min并洗滌2次。最后FITC熒光染料標記的兔二抗孵育，室溫30 min。細胞洗滌2次，用1%多聚甲醛溶液固定，上流式細胞儀分析。以CD45和Col Ⅰ作為循環纖維細胞的表面標記，通過流式細胞儀對CD+45、Col Ⅰ+雙陽性的外周血白細胞進行計數，結果以CD+45/Col Ⅰ+雙陽性細胞占白細胞總數的百分比表示[6]。

1.2.4腎臟功能及病理評分方法取術后第4、8、12周留取的外周血，檢測Sor、BUN。參考Gadola等[7]所述方法，在光鏡下對腎臟病理進行半定量積分。腎小球的硬化程度積分：0分(正常腎小球)；1分(系膜區擴張或硬化面積<25%)；2分(硬化面積25%～50%)；3分(硬化面積50%～75%)；4分(硬化面積>75%)，每個標本400倍光鏡下觀察20個腎小球，求平均數作為腎小球硬化指數。腎小管間質積分：根據腎小管萎縮、管型、間質炎癥和纖維化的范圍，分別給0～3分：0分(無小管間質損害)；1分(病變范圍<25%)；2分(病變范圍25%～50%)；3分(病變范圍>50%)。在100倍光鏡下，每個標本觀察10個視野，求平均數作為腎間質小管病變指數。

2結果

2.1腎組織病理學改變對照組大鼠第4、8、12周腎小球、腎小管、間質及血管無明顯改變。隨著造模時間延長，模型組大鼠腎小球系膜細胞增生，系膜基質增多，腎小球包曼囊壁增厚或分層，部分可見壁層上皮細胞增生及球囊粘連，部分腎小球節段性或球性硬化；腎小管萎縮或代償性擴張，部分出現顆粒變性及空泡變性；腎間質增寬，可見大量灶性炎癥細胞浸潤及灶性纖維化。見插頁Ⅰ圖2。模型組的腎小球積分、腎小管間質積分均顯著高于對照組(P均<0.01)。見表1。

±s)

注：與同周齡對照組比較，#P<0.05，*P<0.01。

2.2血生化檢測結果見表2。

2.3外周血循環纖維細胞計數見表3。

2.4外周血纖維細胞計數與腎纖維化的關系將模型組大鼠循環纖維細胞與Scr、BUN及腎臟病理積分做相關性分析顯示，循環纖維細胞與Scr、BUN及腎臟病理積分均呈正相關(r分別為0.623、0.550、0.613，P分別<0.01、0.05、0.01)。

3討論

循環纖維細胞具有類似于成纖維細胞的功能如分泌膠原蛋白和其他基質蛋白，同時還表達造血細胞的表面標記如CD34、CD45、MHC Ⅱ類分子等。因此，鑒別循環纖維細胞的基本標準是同時具有膠原生成和血源細胞標記。當前比較成熟的鑒定循環纖維細胞的標記分子有CD34、CD45、Col Ⅰ等[8,9]。循環纖維細胞可以通過多個炎癥/免疫反應機制，如抗原表達、分泌細胞因子和趨化因子、產生基質金屬蛋白酶等參與組織纖維化過程[10]。CCL2/CCR2信號轉導通路是其發揮作用的一個重要途徑[11]。目前已多項研究證實，循環纖維細胞數量與特發性肺炎、移植腎病變程度相關[12,13]。

腎纖維化的特點是細胞外基質成分過度累積，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，糖蛋白和纖維連接蛋白等[14]。關于腎臟基質細胞的來源有如下幾種可能：①腎臟固有間質成纖維細胞被激活；②腎小管上皮細胞的上皮間質轉化(EMT)；③來自血液循環中的纖維細胞浸潤[15]。纖維細胞在腎纖維化中的詳細作用機制尚不清楚，但既往研究證實纖維細胞確實參與了腎纖維化進程中[16]。Sakai等[17]研究表明，在輸尿管結扎小鼠進展性腎纖維化模型中，腎間質可見CD45和Ⅰ型膠原雙陽性的纖維細胞浸潤，皮髓交界區尤為明顯。

±s)

注：與同周齡對照組比較，*P<0.01。

±s)

注：與同周齡對照組比較，*P均<0.01。

腎活檢病理檢查是確定腎臟損傷的金標準，但由于其創傷性較大，并對操作技術有較高要求。因此，尋找更簡便的、適用于臨床的腎纖維化生物學標志物，對腎纖維化早期監測以及給予適時治療方略進一步改善慢性腎臟病的預后至關重要。本研究以外周血循環纖維細胞作為潛在的生物學標志物，通過5/6腎切除大鼠腎衰模型，比較外周血纖維細胞計數的變化及與腎臟病理、血生化指標的關系，結果顯示，模型組大鼠外周血循環纖維細胞隨著腎臟損害的加重而逐漸增加，且與腎臟纖維化程度及血肌酐水平呈正相關，提示其可作為腎纖維化早期的生物學標志物指標。

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Significance of peripheral blood fibrocytes counting to renal fibrosis rats

DANGYan-mei,LIXin-jian,ZHANGShao-qing,QUXiao-han,WEIMing-ming,ZHANGKun

(AffiliatedHospitalofJiningMedicalCollege,Jining272029,China)

Abstract:ObjectiveTo discuss the significance of peripheral blood fibrocytes counting to renal fibrosis rats with 5/6 kidney cut. MethodsCD45and type I collagen were as the circulation fibrocytes surface markers; the flow cytometer was used to count the peripheral blood fibrocytes of rats with 5/6 kidney cut; biochemical indexes of renal function and the pathological alteration in kidney were measured. ResultsFor the model group of rats with renal failure, in 4, 8 and 12 weeks after modeling, the peripheral blood fibrocytes counting increased significantly compared with the control group (allP<0.01). The blood fibrocytes counting was positively correlated with renal pathology changes, Scr and BUN (P<0.05 orP<0.01). ConclusionThe peripheral blood fibrocytes counting is positively correlated with renal pathology changes in early renal fibrosis, which can indicate early the development process of renal fibrosis.

Key words:circulating fibrocytes; chronic renal failure; renal fibrosis; rat

(收稿日期：2014-11-06)

中圖分類號：R692.5

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)04-0021-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.007

作者簡介：第一黨艷梅(1963-)，女，碩士研究生導師，主任醫師，教授，腎內科副主任，研究方向為腎纖維化的早期診斷及治療。E-mail: dangyanmei@126.com

基金項目：山東省自然科學基金資助項目(ZR2011HL017)。