橙皮苷對四環素所致小鼠脂肪肝的保護作用

姚曉敏，倪銘，李越，魏玲，林愛斌，李宏偉(浙江醫藥高等專科學校，浙江寧波 3500；北京市理化分析測試中心)

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橙皮苷對四環素所致小鼠脂肪肝的保護作用

姚曉敏1，倪銘1，李越2，魏玲2，林愛斌1，李宏偉1(1浙江醫藥高等專科學校，浙江寧波 315100；2北京市理化分析測試中心)

摘要：目的觀察橙皮苷對四環素引起小鼠非酒精性脂肪肝的保護作用。方法將ICR小鼠分為A、B、C組，A組給予橙皮苷(300 mg/kg)連續灌胃10 d，B、C組給予同體積溶劑；在第10天給藥后1 h時A、B組腹腔注射四環素200 mg/kg 20 mL，C組給予相同pH值等體積生理鹽水。給毒后24 h眼球取血，并取肝臟，檢測血清ALT、AST、TG、TC及肝組織TG、TC、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酯(SOD)、谷胱甘肽(GSH)，HE染色觀察肝臟組織病理學改變。結果與C組比較，B組血清ALT、AST升高而TG、TC降低，肝組織中TG、TC、MDA、GSH升高，P均<0.05；與B組比較，A組血清ALT、AST降低而TG、TC升高，肝組織中TG、TC降低而GSH升高，P均<0.05。C組小鼠肝臟未見明顯病變，B組動物肝臟的中央靜脈和小葉間靜脈周圍出現肝細胞腫脹、水樣變性等病理改變。A組給藥可減輕上述病理改變。結論橙皮苷對四環素所致小鼠脂肪肝具有明顯的保護作用。

關鍵詞：非酒精性脂肪肝；橙皮苷；四環素；甘油三酯；膽固醇

研究發現，非酒精性脂肪肝(NAFLD)患病率在迅速增加，已成為一個世界性的公共衛生問題[1]；其常見病因有肥胖、糖尿病、化學毒物和藥物等[2～6]，但發病機制尚不十分清楚，且無療效確切的治療藥物。橙皮苷是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷，廣泛存在于豆科、唇形花科、碟形花科、蕓香科、柑橘屬植物中。2013年9月～2014年2月，我們觀察了橙皮苷對四環素所致小鼠NAFLD是否有保護作用，為橙皮苷的臨床應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：ICR小鼠30只，雄性，體質量20～22 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術公司；實驗期間飼養于屏蔽級動物房，每日明暗室各12 h，恒溫恒濕，標準飼料，自由飲水。藥品和試劑：鹽酸四環素(CAS)購自Ameresco公司，ALT、AST、TG、TC、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；橙皮苷(95%)購自南京澤朗醫藥科技有限公司，聯苯雙酯滴丸(批號：13010104)購自北京市地壇醫院；其他試劑均為分析純化學試劑。實驗儀器：電子顯微鏡(80i，Nikon)，超聲波清洗器(SB25-120，寧波新芝生物科技)，勻漿機(IKA T10，basic)，加熱制冷水浴槽(GD120-S12，Grant)，電子天平(LA5002，上海精天電子儀器公司)，多功能酶標儀(varianscan Flash，Thermo)，超級恒溫水浴鍋(HH601，金壇科興)，酸度計(PHS-3C，上海精密科學儀器廠)，高速離心機(TGL-16B，上海安亭科學儀器廠)。

1.2方法

1.2.1動物分組與造模小鼠隨機分為A、B、C組各10只，A組給予橙皮苷(300 mg/kg)連續灌胃10 d，B、C組給予同體積溶劑；在第10天給藥后1 h時，A、B組腹腔注射四環素200 mg/kg 20 mL，C組給予相同pH值等體積生理鹽水。給毒后24 h眼球取血，并取肝臟進行檢測。

1.2.2血清ALT、AST、TG、TC測定小鼠腹腔注射四環素后24 h眼球取血，3 500 r/min離心10min，分離血清，檢測血清ALT、AST、TG、TC。

1.2.3肝組織TG、TC測定小鼠眼球取血后取肝臟，取同一部位肝組織；于冰浴上以無水乙醇制成10%肝勻漿，2 500 r/min離心10 min；取上清液，按試劑盒說明測定肝組織中的TG、TC。

1.2.4肝組織MDA、SOD、GSH測定取同一部位肝組織，于冰浴上以生理鹽水制成10%肝勻漿，根據試劑盒說明測定肝組織中的MDA、GSH、SOD。

1.2.5肝組織病理學觀察取肝臟大葉同一部位組織，以10%甲醛固定；HE染色后，顯微鏡下觀察肝細胞是否出現壞死、水樣變變性，脂肪樣變性，炎性細胞浸潤等。

2結果

2.1各組小鼠血清ALT、AST、TG、TC比較見表1。

組別ALT(U/L)AST(U/L)TC(mg/dL)TG(mg/dL)A組23.28±6.22#30.13±4.62#140.26±17.56#88.50±44.83#B組49.07±16.20*38.68±5.41*111.32±24.52*37.86±19.06*C組12.80±2.3826.27±7.02189.36±32.41106.12±19.01

注：與C組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.05。

2.2各組小鼠肝組織中TC、TG比較見表2。

組別TC(mmol/g)TG(mmol/g)A組29.16±7.69##179.61±51.94#B組43.09±5.55*263.12±51.34*C組33.23±2.99106.00±15.70

注：與C組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.05,##P<0.01。

2.3各組小鼠肝組織中MDA、SOD、GSH比較見表3。

表3　各組小鼠肝組織中MDA、SOD、GSH

注：與C組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.01。

2.4各組小鼠肝臟組織形態學改變C組小鼠肝臟未見明顯病變，B組動物肝臟的中央靜脈和小葉間靜脈周圍出現肝細胞腫脹、水樣變性等病理改變，A組給藥可減輕上述病理改變。見插頁Ⅲ圖6。

3討論

橙皮苷分子結構中含有多個羥基，有酸性，有親水性，屬黃酮物質的黃烷酮。近年來，發現其具有抗氧化、抗過敏、降低膽固醇、保肝、降血壓、抗腫瘤等藥理作用[6～8]，還能清除生物體的自由基，提高機體免疫力。李慧等[9]研究發現，橙皮苷能極顯著地降低蛋黃乳所致高脂血癥小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，并能升高HDL-C。因此，橙皮苷具有顯著的降血脂作用。但是，橙皮苷對四環素所致NAFLD的作用尚未見報道。

四環素是引起NAFLD的藥物之一，可誘發小泡性脂肪肝。其發生機制主要是損傷線粒體脂肪酸β氧化，降低微粒體甘油三酯轉移蛋白活性，從而抑制肝臟極低密度脂蛋白(VLDL)釋放[10，11]。本研究結果顯示，單劑量四環素小鼠腹腔注射能夠引起肝臟脂肪變性，表現為血清AST和ALT明顯升高、TC和TG顯著降低，肝組織脂質TC和TG明顯聚積，肝細胞出現小泡性脂質聚集、水樣變性和壞死，上述結果均可反映四環素誘導小鼠出現脂肪肝的早期變化。而橙皮苷預防給藥能抑制四環素所致小鼠血清ALT和AST水平升高、調節降低的TG和TC濃度、抑制肝臟TG和TC的蓄積，改善肝臟組織病理學損傷，從而保護四環素所引起的NAFLD。

本研究結果顯示，小鼠腹腔注射四環素后肝組織脂質過氧化產物MDA明顯增多，抗氧化物GSH含量出現升高，可考慮為抗氧化物的升高屬于代償性，以利于自由基清除。而橙皮苷預防給藥對MDA增多的抑制不明顯，但是可進一步升高抗氧化物GSH水平。由此推測，橙皮苷保護四環素引起小鼠脂肪肝部分與其抗氧化作用相關。

參考文獻：

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(收稿日期：2014-08-21)

中圖分類號：R963

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)04-0028-02

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.010

基金項目：浙江省教育廳科研項目(Y201122579)；浙江醫藥高等專科學校2011年度重點課題項目(ZPCSR2011001)；浙江省大學生科技創新項目(2014R433004)；浙江省寧波市自然科學基金項目(2012A610 245)。