5株北極微藻藻際環境的細菌多樣性

苗 禎，杜宗軍，李會榮，樓妍穎，羅 瑋,*

1 山東大學(威海)海洋學院，威海 264209 2 中國極地研究中心，國家海洋局極地科學重點實驗室，上海 200136

5株北極微藻藻際環境的細菌多樣性

苗 禎1,2，杜宗軍1，李會榮2，樓妍穎2，羅 瑋2,*

1 山東大學(威海)海洋學院，威海 264209 2 中國極地研究中心，國家海洋局極地科學重點實驗室，上海 200136

對5株北極微藻，如脆桿藻(Fragilariopsissp.)、微單胞藻(Micromonassp.)、四棘藻(Attheyaseptentrionalis)、海鏈藻(Thalassiosirasp.)和小球藻(Chlorellasp.)的不同生長時期的粘附細菌和游離細菌的16S rRNA基因進行PCR-DGGE分析，研究藻際環境的細菌多樣性。結果表明，5株微藻具有不同的藻際微生物群落結構組成，其中微單胞藻、脆桿藻、四棘藻和海鏈藻的藻際細菌主要由Cyanobacteria(藻藍細菌)、α-Proteobacteria(α-變形菌綱)和γ-Proteobacteria(γ-變形菌綱)組成，僅微單胞藻和脆桿藻檢測出CFB(Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides，噬纖維菌-屈撓桿菌-擬桿菌)。小球藻由Cyanobacteria、CFB、α-Proteobacteria和β-Proteobacteria(β-變形菌綱)組成。微單胞藻的藻際菌群結構穩定，不同生長時期的游離細菌和粘附細菌組成差異不明顯。3株硅藻-脆桿藻、四棘藻和海鏈藻的游離細菌主要由γ-Proteobacteria組成，小球藻的游離細菌主要為β-Proteobacteria，而5株微藻的粘附細菌主要由Cyanobacteria組成。從DGGE圖譜來看，在脆桿藻生長的延滯期、指數期和穩定期，其藻際游離細菌和粘附細菌的16S rRNA基因擴增條帶數量和位置均有明顯差異，但優勢擴增條帶較穩定；其他4株藻粘附細菌和游離細菌的擴增條帶比較穩定，說明藻際關聯菌群結構較穩定。藻菌種間特異性關系為不同微藻藻株提供了重要的線索，同時也帶來更多的隱藏在藻際環境中的信息。

北極微藻; 藻際環境; 關聯菌群; 16S rRNA; DGGE

微藻分泌的胞外產物對細菌食物鏈具有重要作用，形成了自微藻細胞向外至一定距離的對細菌生長有刺激作用的區域，類似于陸上的根際環境，這個區域被命名為“藻際環境”(phycosphere)[1]。有研究表明藻際環境的游離細菌和粘附細菌群落結構是不同的[2- 3]，Fandino等研究表明在腰鞭毛藻赤潮期間游離細菌主要屬于α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria，粘附細菌主要以CFB菌群占優勢[3]。Sch?fer 等研究了6種不同的藻株附著不同的“衛星”細菌群落，而且基因指紋顯示這種“衛星”附著關系較為穩定。所有藻株附著類群的共同點就是均歸屬于α-Proteobacteria和CFB其中的某一個支系[4]。也有研究表明海洋藻際環境中細菌群落和海洋中的游離細菌群落在系統發育上有著明顯的區別，說明兩種不同生存環境下的細菌種群結構組成由不同的選擇性壓力所影響[5- 6]。更多的生態調查研究表明在浮游植物赤潮過程中細菌群落組成與浮游植物的組成、生長和生理狀態相關[4- 5,7- 8]。特定藻類能吸引不同細菌附生群落，顯示浮游植物-細菌相互作用具有種間特異性[4,6,9]，而菌群對某些微藻的表現出“溶藻”[10]或者“共促”機理[11]都證明了藻、菌關聯之間的特異性。

北極地區是受全球變化影響最深的地區，極地海洋系統易于受到周圍環境等因子的影響，已經引起科學家對這些極端區域海洋微生物的多樣性和生態學作用的極大興趣。目前極地海洋微生物多樣性研究多以海冰、海水和近岸沉積物微生物群落為研究對象，對北極海域浮游細菌系統發育多樣性的研究表明，浮游細菌主要分布在α-、γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、ε-Proteobacteria、CFB類群、綠色非硫細菌和Verrucomicrobia這7個大的類群。這些克隆序列跟多數非培養的環境序列存在高度同源性[12]。人們利用傳統培養技術和分子生物學技術開展了對北極楚科奇海、弗拉姆海峽、斯匹次卑爾根島嶼附近峽灣海冰樣品的細菌系統發育多樣性分析。海冰細菌主要屬于α、γ-Proteobacteria、CFB、低G+C含量革蘭氏陽性菌群和高G+C含量革蘭氏陽性菌群[13- 15]。而極區微藻也是常見的浮游植物類群，是重要的初級生產力類群，北極海域的主要優勢種類為青綠藻和硅藻。它們同樣在北冰洋生態系統的碳固定過程中起著重要的作用。目前人們熱衷于極地快速變化環境下的特定種群(浮游植物，浮游細菌，浮游動物等)的生態學調查，而在這種迅速變化的生境中的生態系統反饋和應對機理需要更多的摸索和一些全新的理解。在此背景下，展開針對北極獲得的幾株優勢微藻藻際環境中藻菌關聯的機理的研究。

基于對北極的優勢浮游植物-細菌相互作用機制的探索為目的，從北極各生境中分離出的具重要生態地位的微藻，并對與這些微藻緊密關聯的微生物群落多樣性進行研究，將對認識北極海域微食物環以及其中的各個生態學角色有了更深入的認知。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養

本研究中的5株北極微藻，信息見表1。海洋微藻微單胞藻(Micromonassp.)、脆桿藻(Fragilariopsissp.)、四棘藻(Attheyaseptentrionalis)和海鏈藻(Thalassiasirasp.)購自美國國家海洋藻類和微生物中心(NCMA, Maine, USA)，淡水藻小球藻(Lw 2006/68)采自2006年中國第3次北極黃河站考察，北極斯匹次卑爾根群島黃河站(78°55′N, 11°56′E)附近的夏季冰川融水坑，樣品低溫((6±0.5) ℃)保存回國，在實驗室分離純化并保存于中國極地研究中心藻種庫。

表1 本研究中使用的微藻Table 1 Microalgae strains used in this study

微藻培養在光照培養箱中進行，溫度為(6±0.5) ℃，光強為2000 lx，光照周期為光∶暗=12 h∶12 h。所有藻株的培養基參照表1，海水均采自北極海域，將海水通過0.45 μm的膜過濾，121 ℃，20 min進行滅菌。維生素溶液通過0.2 μm濾器進行除菌。

1.2 微藻生長曲線的測定

微藻計數主要采用光學顯微鏡細胞計數[16]。取100 μL混勻的藻液均勻加入細胞計數板中，光學顯微鏡(Olympus)(10×40)觀察計數。計數從第0天開始，每2 d計數1次。

1.3 藻際環境的細菌采樣

取不同生長期的藻液10 mL直接通過0.2 μm的聚碳酸膜(Whatman)過濾，獲得游離和粘附的總細菌。取不同生長期的藻液10 mL，先經膜過濾，獲得微藻細胞的粘附細菌(Attached)；其中Micromonassp.由于細胞約為2.0—3.0 μm，選用孔徑為2.0 μm的濾膜，其他藻株選用3.0 μm濾膜。將濾液再通過0.2 μm的濾膜，獲得藻液中的游離細菌。濾膜及樣于冰箱-80 ℃保存。

1.4 DNA提取

DNA提取參照Zhou等[17]的方法進行。

1.5 16S rRNA基因全長序列 PCR

參照 Bosshard 等[18]的方法進行。16S rRNA基因引物序列如下：27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3′) 和1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3′)。PCR 反應條件為 94 ℃變性 4 min, 然后在 94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min 循環30次, 72 ℃延伸10 min。

1.6 16S rRNA 基因V3 區的PCR擴增

采用Shabir等[19]的方法進行。引物的序列如下：341F (5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAG GGG AGG CAG CAG- 3′) 和534R (5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG- 3′)，下劃線處為GC鉗序列。PCR擴增在Veriti Thermal Cycler(ABI)上進行。以 1 μL 16S rRNA全長序列 PCR 產物作為模板，PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，然后是30循環(94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min。

1.7 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

800 ng—1 μg 16S rRNA基因V3區擴增產物進行DGGE分離。用D-code System電泳儀(Bio-Rad公司)進行DGGE電泳分離。制備變性梯度凝膠，使PAGE膠濃度為8%，變性梯度40%—60%(7 mol/L尿素和40%甲酰胺為100%變性)，電泳緩沖液為1×TAE，PCR產物在60 ℃，200 V條件下電泳6 h。電泳完畢，用GelRedTM(Biotium)染色45—60 min。DGGE圖譜通過Gel Doc 2000凝膠成像系統 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)獲得。

將聚丙烯酰胺凝膠中在同一個水平位置的條帶割下，放在PCR小管中，并加入20 μL MilliQ水，放在4 ℃冰箱過夜，以此為模板，進行16S rRNA V3 區 PCR擴增，實驗條件同上。

1.8 DNA序列測序和分析

按照pMD18-T載體試劑盒(Takara，大連)說明進行操作。將16S rRNA基因V3區擴增產物分別同pMD18-T載體連接，連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中。涂布至含有氨芐青霉素SOC平板上，37 ℃培養12 h。每個平板挑取克隆，接入500 μL SOC液體培養基37 ℃培養，經 T 載體引物 PCR 擴增篩選陽性克隆，擴增引物為 M13+(5′-GTA AAA CGA CGG CCA G - 3′)和 M13-(5′- CAG GAA ACA GCT ATG AC - 3′)，送去(南方基因測試中心)測序。測序獲得的16S rRNA序列進行BLAST比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，應用CLUSTALX1.8(多重序列比對程序)進行匹配比對，后用PHYLIP 3.67(進化樹分析)構建進化樹[20]。

1.9 聚類分析

根據電泳條帶的有無，運用圖像分析軟件Quantity One(4.6.2)分析DGGE圖譜，采用UPGMA法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 生長曲線測定結果

5株微藻的生長曲線見圖1。從圖1中可以看出，5株微藻的生長周期約為30 d。小球藻的3個生長階段不明顯，將小球藻3個生長階段大致劃分，延滯期約為7 d，隨后進入指數生長期，在21 d達到最大密度，隨后略微下降并穩定生長。其他4株微藻的生長階段較明顯，脆桿藻、四棘藻、海鏈藻和微單胞藻的延滯期分別為前9 d、5 d、12 d和9 d，在16 d、14 d、27 d和16 d達到最大生長密度，隨后進入穩定生長期。藻液分別取自各個藻株的生長延滯期、指數期和穩定期(圖1)。

圖1 5種不同微藻的生長曲線Fig.1 The growth curve of five different microalgae involved into this study

2.2 藻際微生物多樣性分析

從DGGE電泳圖譜(圖2A，圖3A，圖4A，圖5A，圖6A)可以看出，5株微藻藻際細菌群落的條帶的數目和位置有所區別，說明不同藻株的藻際細菌群落組成不同。5種藻際細菌群落的優勢種均十分明顯，分別對應于DGGE圖譜中的亮條帶。較微弱DGGE條帶所對應的細菌類群的數量可能相對較低。

基于5株微藻藻際細菌的DGGE圖譜主要條帶，共獲得59條克隆序列(其中一條測序失敗)，它們的測序結果經BLAST比對顯示(表2)，5株微藻藻際細菌種群與數據庫中的已知序列的相似性為87%—100%，包括： Cyanobacteria、CFB菌群、α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria(圖7)。由表2和系統進化樹

(圖7)可以看出,從5株微藻培養液獲得的細菌數量和類群有所不同。微單胞藻、脆桿藻、四棘藻和海鏈藻的藻際細菌中，主要由Cyanobacteria、α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria組成，僅微單胞藻和脆桿藻檢測出CFB菌群。淡水藻株小球藻是由Cyanobacteria、CFB菌群、α-Proteobacteria、β-Proteobacteria，而無γ-Proteobacteria。無論是哪種微藻，群落的優勢種都十分明顯，它們分別對應于DGGE泳道中的亮條帶。從DGGE圖和系統進化樹中可以看出，微單胞藻藻際優勢菌群為Cyanobacteria和γ-Proteobacteria(圖7中M表示)；脆桿藻藻際優勢菌群為Cyanobacteria、CFB和γ-Proteobacteria(圖7中F表示)；小球藻藻際優勢類群為Cyanobacteria和β-Proteobacteria(圖7中C表示)；四棘藻藻際優勢類群為Cyanobacteria(圖7中A表示)；海鏈藻藻際優勢類群為Cyanobacteria和γ-Proteobacteria(圖7中T表示)。可以發現Cyanobacteria和γ-Proteobacteria在這幾株微藻的藻際環境中廣泛存在。

圖2 脆桿藻藻際細菌群落的16S rRNA基因V3區的DGGE圖譜和聚類分析圖(T: 總細菌;A: 粘附細菌;F:游離細菌)Fig.2 DGGE patterns and cluster analysis of 16S rRNA gene V3 region amplification fragments of bacteria community in the phycosphere of Fragilariopsis sp.

脆桿藻藻際細菌測序的DGGE條帶有14條(圖2A)，屬于γ-Proteobacteria和Cyanobacteria的序列各有5條，屬于α-Proteobacteria和CFB的序列各有2條。其中α-Proteobacteria的序列屬于紅細胞科的亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)，γ-Proteobacteria的序列屬于海洋桿菌屬、希瓦菌屬和假交替單胞菌科的交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)等屬，CFB的序列屬于奧文氏菌屬(Owenweeksia)，Cyanobacter的序列屬于鹽螺旋菌屬(Halospirulina)。亮度較高的條帶為Band_17、 Band_18、Band_19、Band_23和Band_24。Band_17屬于奧文氏菌屬，與香港牛尾海分離獲得香港奧文氏菌(Owenweeksiahongkongensis)相似性為95%，與普拉姆島沿岸未培養擬桿菌細菌克隆PI_4b12a相似性為99%。Band_18，Band_19屬于Chroococcales目，與Halospirulinatapeticola相似度為91%，與墨西哥灣沿岸海水中未培養Cyanobacterium克隆CM01187X1E11相似性分別為99%和100%。Band_23屬于海洋桿菌屬，與北極海冰中的嗜冷海桿菌相似性為99%。Band_24屬于Chromatiaceae綱，與海洋沉積物中加拿大希瓦菌(Shewanellacanadensis)的相似性為93%，與來自密歇根湖近岸的未培養的Chromatiaceae綱的細菌克隆 Gap- 2- 29相似性為95%。

從四棘藻獲得的DGGE條帶有12條(圖3A)，與γ-Proteobacteria相似的序列有6條，與α-Proteobacteria和Cyanobacteria相似的序列各有3條。其中α-Proteobacteria的序列屬于陸丹式菌屬(Loktanella)，γ-Proteobacteria中的序列屬于交替單胞菌科海洋桿菌屬和冰居桿菌屬、假交替單胞菌科的交替假單胞菌屬、甲基球形菌屬(Methylosphaera)和寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)等，Cyanobacteria的序列屬于鹽螺旋菌屬。亮度較高的條帶Band_39 、Band_40均屬于Chroococcales目，與已鑒定的Halospirulinatapeticola相似度為91%,與來自墨西哥灣沿岸海水未培養Cyanobacterium克隆PI_4g9g相似性為100%。

海鏈藻DGGE主要條帶有13條(圖4A)，與γ-Proteobacteria相似的序列有7條，與α-Proteobacteria相似的序列有2條，與Cyanobacter相似的序列有4條。其中α-Proteobacteria中的序列屬于紅細胞科的亞硫酸鹽桿菌屬和赫夫勒氏菌屬(Hoeflea)，γ-Proteobacteria中的序列屬于假單胞菌科的假單胞菌屬(Pseudomonas)和鐵還原單胞菌屬(Ferrimonas)，Cyanobacteria中的序列屬于Rubidibacter屬和原綠球菌屬。亮度較高的條帶有5條，分別是Band_49、Band_51和Band_55 屬于γ-Proteobacteria，Band_54 、 Band_56 屬于Cyanobacteria。Band_49、Band_51和Band_55與鐵還原單胞菌屬相似性最高，與日本灣Ferrimonaskyonanensis相似性分別為95%、94%和95%，Band_49與來自東部熱帶北太平洋的未培養γ-Proteobacteria克隆JL-ETNP-R18相似性為96%。Band_51和Band_55與來自墨西哥灣深海的未培養γ-Proteobacteria克隆OV01102/03和H10- 120相似性分別為95%和96%。Band_54與Rubidibacter屬相似性最高，與來自西太平洋楚克環礁海水Rubidibacterlacunae相似性為91%，與低鹽度潮汐沉積物的未培養Cyanobacteria的克隆D05RT35相似性為100%。Band_56與海洋原綠球菌(Prochlorococcusmarinus)相似性為87%，與海洋環境中未培養的Cyanobacterium克隆SGPW483相似性為97%。

微單胞藻藻際細菌測序的DGGE條帶為12條(圖5A)，分別屬于α-Proteobacteria(1條)、γ-Proteobacteria(6條)、 Cyanobacter(3條)和CFB(2條)，其中α-Proteobacteria的序列屬于紅細胞科的十八桿菌屬(Octadecabacter)，γ-Proteobacteria的序列屬于海洋桿菌(Marinobacter)、希瓦菌屬(Shewanella)、嗜冷單胞菌屬(Psychromonas)、深海彎菌屬(Thalassolituus)和倫黑墨氏菌屬(Rheinheimera)等屬，CFB的序列屬于Leadbetterella屬，Cyanobacter的序列屬于原綠球菌(Prochlorococcus)屬。亮度較高的Band_4 、Band_5 、Band_8和Band_9 均屬于γ-Proteobacteria。其中Band_4和Band_8與希瓦菌屬(Shewanella)相似性最高，與海洋沉積物獲得的加拿大希瓦菌(Shewanellacanadensis)相似性分別為92%和94%，Band_4與Norweigian深海水環境的未培養細菌克隆Kwat47相似性為98%。Band_8與來自密歇根湖近岸的未培養細菌克隆Gap- 2- 29相似性為95%。Band_5與海洋原綠球菌(Prochlorococcusmarinus)相似性為87%，與南極冰川附近海水未培養的細菌克隆IB0346E7相似性為100%。 Band_9為海洋桿菌屬(Marinobacter)，與來北極海冰嗜冷海桿菌(Marinobacterpsychrophilus)相似性為100%。

小球藻藻際細菌測序的DGGE條帶有7條(圖6A)，屬于α-、β-Proteobacteria和Cyanobacteria的序列各有2條，僅1條屬于CFB。α-Proteobacteria中的序列屬于中間根瘤菌屬(Mesorhizobium)和短波單胞菌屬(Brevundimonas)，β-Proteobacteria中的序列屬于Herminiimonas屬，CFB中的序列屬于比自歐式屬(Bizionia)，Cyanobacteria中的序列屬于鹽螺旋菌屬。亮度較高的條帶Band_29、Band_30和Band_31，Band_29屬于Herminiimonas屬，與來自瓶裝礦物水的Herminiimonasfonticola相似性為99%。Band_30、Band_31屬于Chroococcales目，與Halospirulinatapeticola相似性為91%,與來自墨西哥灣沿岸海水的未培養Cyanobacterium克隆Gap- 3- 60相似性分別為100%和99%。

Cyanobacteria和α-Proteobacteria在5株微藻藻際環境中均有發現。脆桿藻、小球藻和四棘藻藻際細菌Cyanobacteria的條帶相同(均為Halospirulinatapeticola)，而微單胞藻和海鏈藻藻際細菌Cyanobacteria是有相同的條帶，相同條帶為Prochlorococcusmarinus，與其他3株的Cyanobacteria不同。脆桿藻和海鏈藻藻際環境均有α-Proteobacteria的Sulfitobacter屬的細菌。β-Proteobacteria只在淡水的小球藻中存在。除小球藻，其他海洋微藻均有γ-Proteobacteria存在。其中微單胞藻、脆桿藻和四棘藻藻際環境中，均有Shewanella屬的細菌。而在脆桿藻、四棘藻和海鏈藻中有Pseudoalteromonas屬的細菌。Marinobacter屬的細菌在微單胞藻和脆桿藻的藻際環境中存在。

2.3 不同微藻藻際粘附細菌和游離細菌多樣性

微單胞藻藻際細菌16S rRNA基因DGGE電泳圖譜聚類分析(圖5B)顯示游離細菌和粘附細菌分別各自聚為一簇，但是兩者之間的相似性指數達到80%以上，說明微單胞藻藻際游離細菌和粘附細菌無顯著變化。

脆桿藻、四棘藻、海鏈藻和小球藻聚類分析(圖2B、圖3B、圖4B、圖6B)顯示游離細菌和粘附細菌各自聚為一簇，相似性分別為45%、68%、56%和60%，說明游離細菌和粘附細菌多樣性顯著不同。根據圖2—圖4、圖6和表2也可以看出，脆桿藻中游離細菌由CFB和γ-Proteobacteria組成，粘附細菌由Cyanobacteria組成；小球藻游離細菌由β-Proteobacteria組成，粘附細菌由Cyanobacteria組成；四棘藻的游離細菌由γ-Proteobacteria組成，粘附細菌由Cyanobacteria組成；海鏈藻的游離細菌由α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria，粘附細菌由Cyanobacteria和α-Proteobacteria組成。

2.4 不同生長期的藻際細菌多樣性

脆桿藻藻際細菌聚類分析(圖2B)顯示游離細菌在脆桿藻生長的延滯期(F9)、指數期(F16)與穩定期(F23)相似性在75%以上，與F0的相似性為53%，說明游離細菌的群落結構在脆桿藻不同生長期無明顯變化，只是與脆桿藻剛培養時的細菌群落發生了明顯變化。在延滯期時游離細菌的DGGE條帶有5條，而在穩定期游離細菌的條帶有8條(圖2A)。粘附細菌中，相似度最高的是穩定期(A23)和A0，為67%，與延滯期(A9)相似度最低，為50%，說明粘附細菌在脆桿藻的不同生長時期的多樣性不同，在延滯期時粘附細菌的條帶僅有4條，而到了穩定期粘附細菌的條帶達到11條(圖2A)，γ-Proteobacteria和CFB多樣性增加，并且α-Proteobacteria也被檢測到。生長初期游離細菌和粘附細菌的多樣性有明顯差異，且游離細菌多樣性較為豐富。到了生長末期，游離和粘附細菌群落組成更加豐富。

四棘藻藻際細菌聚類分析(圖3B)顯示游離細菌在四棘藻生長的延滯期(F5)與剛培養時(F0)相似度在80%以上，而F5和F0與指數期(F14)聚在一起，相似度在70%以上，而這3個時期的游離細菌與穩定期的相似度最低，僅為25%。粘附細菌中指數期(A14)和穩定期(A23)相似度在90%以上，與延滯期(A5)的相似度也在85%以上，說明游離細菌或粘附細菌多樣性在四棘藻各個生長期并沒有太大的變化。Band_39、Band_40微藻各個生長階段的粘附狀態的豐度比游離狀態的多。

圖3 四棘藻藻際細菌群落的16S rRNA基因V3區的DGGE圖譜和聚類分析圖(T: 總細菌;A: 粘附細菌;F:游離細菌)Fig.3 DGGE patterns and cluster analysis of 16S rRNA gene V3 region amplification fragments of bacteria community in the phycosphere of Attheya septentrionalis

海鏈藻藻際細菌聚類分析(圖4B)顯示，粘附細菌中，指數期(A19)和延滯期(A9)相似度為95%，這兩個時期與穩定期的相似度為75%。游離細菌中，穩定期(F29)和指數期(F19)相似度為85%，與延滯期的相似度也在73%。說明粘附細菌和游離細菌的多樣性在整個生長周期無明顯變化。DGGE圖譜(圖4A)顯示了豐富的海鏈藻藻際細菌的多樣性，優勢關聯菌群在整個生長周期無明顯變化。其中主要關聯菌群如(Band_49，Band_56)粘附狀態的豐度比游離狀態的少，而Band_51， Band_54， Band_55作為粘附狀態的豐度則比游離狀態的多。

圖4 海鏈藻藻際細菌群落的16S rRNA基因V3區的DGGE圖譜和聚類分析圖(T: 總細菌;A: 粘附細菌;F:游離細菌)Fig.4 DGGE patterns and cluster analysis of 16S rRNA gene V3 region amplification fragments of bacteria community in the phycosphere of Thalassiosira sp.

微單胞藻藻際細菌聚類分析(圖5B)顯示游離細菌在微單胞藻生長的延滯期(F9)、指數期(F19)和穩定期(F27)相似度在85%以上，粘附細菌在微單胞藻生長延滯期(A9)和穩定期(A27)相似度為93%，而微單胞藻延滯期和穩定期的粘附細菌與指數期(A19)相似度最低。說明微單胞藻整個生長周期中，游離細菌和粘附細菌結構穩定。

小球藻藻際細菌聚類分析(圖6B)顯示游離細菌在小球藻生長的穩定期(F27)和指數期(F19)相似度最高，為86%，然后小球藻生長的延滯期和穩定期的游離細菌與延滯期(F7)聚在一起，相似度也在80%以上。粘附細菌在小球藻生長的延滯期(A7)和穩定期(A27)聚在一起，相似度為93%，小球藻在這兩個時期的粘附細菌與指數期(A19)相似度最低，為49%。說明小球藻整個生長周期的關聯菌群多樣性和優勢關聯菌群均較為穩定，無顯著變化，但是粘附細菌和游離細菌的多樣性和優勢菌群則明顯不一致(圖6A)。

圖5 微單胞藻藻際細菌群落的16S rRNA基因V3區的DGGE圖譜和聚類分析圖(T: 總細菌;A: 粘附細菌;F:游離細菌)Fig.5 DGGE patterns and cluster analysis of 16S rRNA gene V3 region amplification fragments of bacteria community in the phycosphere of Micromonas sp.

圖6 小球藻藻際細菌群落的16S rRNA基因V3區的DGGE圖譜和聚類分析圖(T: 總細菌;A: 粘附細菌;F:游離細菌)Fig.6 DGGE patterns and cluster analysis of 16S rRNA gene V3 region amplification fragments of bacteria community in the phycosphere of Chlorella sp.

表2 北極微藻藻際細菌16S rRNA基因DGGE條帶鑒定結果Table 2 DGGE bands of bacterial populations from Arctic microalgae identified by partial 16S rRNA gene analysis

續表

續表

**條帶最亮; *條帶比較亮

3 討論

3.1 不同微藻藻際細菌多樣性

采用PCR-DGGE方法對北極不同生境的5株微藻藻際環境微生物多樣性進行了序列系統發育分析。研究表明，5株北極微藻藻際細菌具有顯著的種間特異性，每個藻株的主要附生微生物群落差異顯著。Sch?fer等通過PCR-DGGE的方法對6株海洋硅藻的附生細菌群落進行分析，6株硅藻具有不同的附生細菌群落，在6株硅藻中檢測出的主要類型都是特有的，只有少數類型在多個硅藻中共同存在[4]。不同微藻藻際細菌群落結構的不同預示著微藻提供為這些細菌提供了特異性的生存條件，從而對細菌進行選擇。研究的3株硅藻藻際細菌γ-Proteobacteria占優勢，α-Proteobacteria占少數，在四棘藻中沒有檢測出CFB，這與Sch?fer等研究的硅藻(雙尾藻、威氏海鏈藻、冰河擬星桿藻、聚生角毛藻和圓篩藻)的藻際細菌主要由α-Proteobacteria和CFB占優勢不同，預示著盡管是相同綱的藻株，其藻際細菌群落結構差異明顯。

根據表2和圖5可以看出，微單胞藻藻際細菌為α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Cyanobacteria和CFB菌群四類。β-Proteobacteria通常在淡水環境中的非常豐富，多數情況下在海洋樣品中的含量是很低或者是無法檢測出來的，因此β-Proteobacteria不是典型的海洋浮游細菌[21- 22]。從淡水藻小球藻藻際細菌發現β-Proteobacteria存在，但是無γ-Proteobacteria。Fisher等對3株淡水綠藻Desmidiumgrevillii、Hyalothecadissiliens和Spondylosiumpulchrum研究顯示克隆的序列中存在β-Proteobacteria[23]。這些結果說明β-Proteobacteria在淡水環境中廣泛存在，γ-Proteobacteria是典型的海洋細菌，盡管在海洋中大量存在，但是在本研究中的小球藻藻際環境中沒有檢測到，預示了γ-Proteobacteria可能在小球藻-細菌間的相互作用并不重要。

Grossart等研究圓海鏈藻和骨條藻這兩株硅藻藻際細菌多樣性，發現細菌主要屬于α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria 和CFB菌群3類，并且α-Proteobacteria的Roseobacter在這兩株硅藻都有存在[5]。在本研究中Cyanobacteria、α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria在3株硅藻：脆桿藻、四棘藻和海鏈藻藻際環境中均有分布，CFB菌群僅在脆桿藻中存在。多種藻類藻際細菌的系統發育分析反映了α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和CFB廣泛存在。

在5株微藻藻際環境中都檢測到Cyanobacteria。在多數極地環境中Cyanobacteria不僅在光合自養微生物占優勢地位，而且構成了微生物生態系統的生物量。有報道在北極海洋存在Cyanobacteria，但是很少是浮游植物的主要成員[24]。

3.2 不同微藻藻際粘附細菌和游離細菌多樣性

微單胞藻細菌結構穩定，游離細菌和粘附細菌的群落結構組成差異并不明顯，幾乎由相同的種類組成，僅在豐度上存在細微的差異(游離細菌和粘附細菌的一些條帶在亮度上有差異，如條帶4在微單胞藻指數期時的條帶)。從圖5A中可以看到，各個條帶在游離細菌和粘附細菌中均存在，說明在微藻培養液中，細菌菌群在游離細菌和粘附細菌中都沒有明顯的差異。

脆桿藻、小球藻、四棘藻和海鏈藻游離細菌和粘附細菌的群落結構組成不同，游離細菌主要由α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria，而粘附細菌主要由Cyanobacteria組成。該結果與Fandino和Grossart研究結果一致[3,5]。在腰鞭毛藻藻際環境中，游離細菌主要由α-和γ-Proteobacteria組成，而粘附細菌則由CFB構成[3]，在硅藻藻際環境中，游離細菌由α-Proteobacteria組成，粘附細菌由CFB構成[5]，說明至少在這兩類微藻中游離細菌、粘附細菌的組成是相似的。并且也有研究表明不同藻種來源的藻際細菌也是不同的。在海洋環境中，硅藻藻際粘附細菌主要由γ-Proteobacteria和CFB組成[25]，在湖泊與河流中，硅藻藻際粘附細菌則主要由β-Proteobacteria組成[26- 27]。因此，推測微藻藻際環境中的細菌類群可能與所處的環境相關。

3.3 不同生長期藻際細菌多樣性

微單胞藻、小球藻、四棘藻和海鏈藻各生長期藻際微生物的DGGE圖譜比較穩定，說明微生物多樣性變化不大，主要差別僅為游離細菌和粘附細菌豐度上有所不同。該結果與Sch?fer的研究結果較一致，Sch?fer發現藻際微生物的DGGE圖譜在整個生長期非常穩定，僅發現2株硅藻海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)和角毛藻(Chaetocerossocialis)存在的微小差異，在不同的時間條帶亮度不同。

脆桿藻藻際細菌的研究結果則顯示粘附細菌的多樣性在延滯期、指數期和穩定期有顯著不同；游離細菌只是在接種時不同，在延滯期、指數期和穩定期細菌群落結構無明顯差異。在延滯期時，脆桿藻粘附細菌的條帶僅有4條，游離細菌的條帶有5條，而到了穩定期粘附細菌的條帶達到11條，游離細菌的條帶有8條，在穩定生長期新出現了α-Proteobacteria的Sulfitobacter屬和γ-Proteobacteria的Shewanella屬細菌。Riemann等在研究由海鏈藻主導的硅藻赤潮時發現，在赤潮到達頂峰時細菌的3種主要種群消失，隨后新的種群出現，主要是由特化的α-Proteobacteria和CFB相關細菌組成，其中α-Proteobacteria主要是玫瑰桿菌屬(Roseobacter)的細菌，而CFB則分布在Flexibacter屬、Cytophaga屬和勒溫氏菌屬(Lewinella)[7]。Grossart等對圓海鏈藻的藻際細菌多樣性研究表明，藻際指數期和穩定期的細菌多樣性顯著不同，在穩定期檢測到細菌數量明顯最多，α-Proteobacteria主要由Roseobacter組成，第二大類CFB則主要有Brumimicrobium屬和極地桿菌屬(Polaribacter)。α-Proteobacteria的數量在指數生長期由22%增長到31%，而在穩定生長期進一步增長至41%[5]。說明海鏈藻的藻際細菌群落結構相似，主要的關聯群落主要是α-Proteobacteria和CFB組成，而脆桿藻的藻際細菌群落結構則明顯不同。楊曉茹對塔瑪亞歷山大藻的微生物多樣性研究也表明指數期的細菌多樣性遠低于延滯期和穩定期[8]。這些研究均與本研究一致，在微藻從剛開始培養至穩定期的轉變過程中，微藻釋放的有機物發現了變化，從而導致游離和粘附細菌的群落結構均發生了變化。α-Proteobacteria的多樣性和數量在穩定生長期增長，預示了α-Proteobacteria更能適應穩定期的微藻藻際環境。

致謝：感謝中國極地研究中心張瑾實驗員對研究的幫助。

[1] Bell W, Mitchell R. Chemotactic and growth responses of marine bacteria to algal extracellular products. Biological Bulletin, 1972, 143(2): 265- 277.

[2] De Long E F, Franks D G, Alldredge A L. Phylogenetic diversity of aggregate-attached vs. free-living marine bacterial assemblages. Limnology and Oceanography, 1993, 38(5): 924- 934.

[3] Fandino L B, Riemann L, Steward G F, Long R A, Azam F. Variations in bacterial community structure during a dinoflagellate bloom analyzed by DGGE and 16S rDNA sequencing. Aquatic Microbial Ecology, 2001, 23(2): 119- 130.

[4] Sch?fer H, Abbas B, Witte H, Muyzer G. Genetic diversity of ‘satellite’ bacteria present in cultures of marine diatoms. FEMS Microbiology Ecology, 2002, 42(1): 25- 35.

[5] Grossart H P, Levold F, Allgaier M, Simon M, Brinkhoff T. Marine diatom species harbour distinct bacterial communities. Environmental Microbiology, 2005, 7(6): 860-873.

[6] Rooney-Varga J N, Giewat M W, Savin M C, Sood S, LeGresley M, Martin J L. Links between phytoplankton and bacterial community dynamics in a coastal marine environment. Microbial Ecology, 2005, 49(1): 163- 175.

[7] Riemann L, Steward G F, Azam F. Dynamics of bacterial community composition and activity during a mesocosm diatom bloom. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(2): 578- 587.

[8] 楊小茹, 蘇建強, 鄭小偉, 周月霞, 田蘊, 寧修仁, 鄭天凌. 基于分子技術的1株產毒藻藻際細菌多樣性分析. 環境科學, 2009, 30(1): 271- 279.

[9] Bates S S, Gaudet J, Kaczmarska I, Ehrman J M. Interaction between bacteria and the domoic-acid-producing diatom Pseudo-nitzschia multiseries (Hasle) Hasle; can bacteria produce domoic acid autonomously? Harmful Algae, 2004, 3(1): 11- 20.

[10] 王新, 周立紅, 鄭天凌, 寧修仁. 塔瑪亞歷山大藻藻際細菌溶藻過程. 生態學報, 2007, 27(7): 2864- 2871.

[11] Ferrier M, Martin J L, Rooney-Varga J N. Stimulation ofAlexandriumfundyensegrowth by bacterial assemblages from the Bay of Fundy. Journal of Applied Microbiology, 2002, 92(4): 706- 716.

[12] Bano N, Hollibaugh J T. Phylogenetic composition of bacterioplankton assemblages from the Arctic Ocean. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(2): 505- 518.

[13] Brinkmeyer R, Knittel K, Jürgens J, Weyland H, Amann R, Helmke E. Diversity and Structure of Bacterial Communities in Arctic versus Antarctic Pack Ice. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(11): 6610- 6619.

[14] Junge K, Imhoff F, Staley T, Deming W. Phylogenetic diversity of numerically important arctic sea-ice bacteria cultured at subzero temperature. Microbial Ecology, 2002, 43(3): 315- 328.

[15] Groudieva T, Kambourova M, Yusef H, Royter M, Grote R, Trinks H, Antranikian G. Diversity and cold-active hydrolytic enzymes of culturable bacteria associated with Arctic sea ice, Spitzbergen. Extremophiles, 2004, 8(6): 475- 488.

[16] 侯建軍, 黃邦欽, 戴相輝. 赤潮藻細胞計數方法比較研究. 中國公共衛生, 2004, 20(8): 907- 908.

[17] Zhou J Z, Bruns M A, Tiedje J M. DNA recovery from soils of diverse composition. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(2): 16- 322.

[18] Bosshard P P, Santini Y, Grüter D, Stettler R, Bachofen R. Bacterial diversity and community composition in the chemocline of the meromictic alpine Lake Cadagno as revealed by 16S rDNA analysis. FEMS Microbiology Ecology, 2000, 31(2): 173- 182.

[19] Dar S A, Kuenen J G, Muyzer G. Nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in complex microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(5): 2325- 2330.

[20] Luo W, Li H R, Cai M H, He J F. Diversity of microbial eukaryotes in Kongsfjorden, Svalbard. Hydrobiologia, 2009, 636(1): 233- 248.

[21] Nold S C, Zwart G. Patterns and governing forces in aquatic microbial communities. Aquatic Ecology, 1998, 32(1): 17- 35.

[22] Gl?Ckner F O, Fuchs B M, Amann R. Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: A first comparison based on fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(8): 3721- 3726.

[23] Fisher M M, Wilcox L W, Graham L E. Molecular characterization of epiphytic bacterial communities on charophycean green algae. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(11): 4384- 4389.

[24] Vincent W F. Cyanobacterial dominance in the polar regions // Whitton B A, Potts M, eds. The Ecology of Cyanobacteria: Their Diversity in Time and Space. Dordrecht: Kluwer, 2002: 321- 340.

[25] Bidle K D, Azam F. Bacterial control of silicon regeneration from diatom detritus: significance of bacterial ectohydrolases and species identity. Limnology and Oceanography, 2001, 46(7): 1606- 1623.

[26] Grossart H P, Simon M. Bacterial colonization and microbial decomposition of limnetic organic aggregates (lake snow). Aquatic Microbial Ecology, 1998, 15(2): 127- 140.

[27] B?ckelmann U, Manz W, Neu T R, Szewzyk U. Characterization of the microbial community of lotic organic aggregates (‘river snow’) in the Elbe river of Germany by cultivation and molecular methods. FEMS Microbiology Ecology, 2000, 33(2): 157- 170.

Analysis of bacterial diversity in the phycosphere of five Arctic microalgae

MIAO Zhen1,2, DU Zongjun1, LI Huirong2, LOU Yanying2, LUO Wei2,*

1MarineCollege,ShandongUniversity(Weihai),Weihai264209,China2StateOceanicAdministrationKeyLaboratoryforPolarScience,PolarResearchInstituteofChina,Shanghai200136,China

As an important primary producer in the marine ecosystem, phytoplankton cells excrete organic compounds. These include high proportions of carbohydrates, amino acids and organic acids, including glycolic acid which forms the base of the marine microbial food web, and affects bacterial growth. Bacteria can live free in the phycosphere and also attached to the surface of algal cells, consuming extracellular products and consequently participate in biogeochemical cycling. Phytoplankton-bacteria interactions range from symbiotic to parasitic interactions, which play an important part in the microbial loop. However, research into phytoplankton-bacterium interactions is limited and yet to be published. The object of this study was to determine the specific associations between dominant algae and associated bacteria in the North Polar Region. We analyzed bacterial diversity in the phycosphere of four Arctic marine microalgae isolates (Micromonassp.,Fragilariopsissp.,AttheyaseptentrionalisandThalassiosirasp.) and one glacial isolate,Chlorellasp..Fragilariopsissp.,Attheyaseptentrionalis, andThalassiosirasp. belong to Bacillariophyta, whileChlorellasp. andMicromonassp. belong to Chlorophyta. The 16S rRNA gene of the attached and free bacteria related to these five microalgae during different growth phases was analyzed by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis. The associated bacterial diversity based on DGGE profiles was rich. These bacteria were clustered into Cyanobacteria, CFB, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, and γ-Proteobacteria. Bacteria in the phycosphere of marine isolatesMicromonassp.,Fragilariopsissp.,AttheyaseptentrionalisandThalassiosirasp. mainly belonged to cyanobacteria, α-Proteobacteria and γ-Proteobacteria. CFB was detected only in the phycosphere ofMicromonassp. andFragilariopsissp. With regard to the only glacial isolateChlorellasp., cyanobacteria, CFB, α-Proteobacteria, and β-Proteobacteria were detected in the majority. Differences in the dominant bacterial species of each microalgae, were distinguished. Cyanobacteria and α-Proteobacteria were detected in the phycosphere of these microalgae. Cyanobacteria bands fromFragilariopsissp.,AttheyaseptentrionalisandChlorellasp. differed from those ofMicromonassp. andThalassiosirasp.Sulfitobacterof α-Proteobacteria coexisted with bothFragilariopsissp. andThalassiosirasp. β-Proteobacteria was traced only from the glacial isolateCholrellasp. γ-Proteobacteria was commonly detected in the four marine microalgal cultures except the glacial isolateChlorellasp..Shewanellawas found closely associated withMicromonassp.,AttheyaseptentrionalisandFragilariopsissp., whilePseudoalteromonaswas associated withAttheyaseptentrionalisandFragilariopsissp. andThalassiosirasp. DGGE profiles and clustering analysis showed that the attached and free bacteria associated withFragilariopsissp. during the lag phase, exponential phase and stationary phase varied, except that the dominant bacteria was constant. Free bacteria in the phycosphere of the three diatom strains were claded into γ-Proteobacteria, while free bacteria associated withChlorellasp. was clustered into β-Proteobacteria. Meanwhile, attached bacteria associated with these four microalgae were comprised mainly of cyanobacteria. However, the attached and free bacteria from the other four microalgae strains were invariable, indicating stability of the bacterial community structure in the phycosphere, except for a slight variation in the abundance of the dominant bacteria. The associated bacterial community related to the Arctic microalgae isolations was analyzed and it would help us recognize the mechanism of phytoplankton-bacteria interaction and their coexisting contribution in the Arctic ecosystem.

arctic microalgae; phycosphere; associated bacteria; 16S rRNA; DGGE

國家863計劃項目(2012AA021706,2013AA065805);南北極環境綜合考察與評估專項(CHINARE2012- 02- 01)

2013- 05- 07;

日期:2014- 04- 17

10.5846/stxb201305070961

*通訊作者Corresponding author.E-mail: luowei@pric.org.cn

苗禎，杜宗軍，李會榮，樓妍穎，羅瑋.5株北極微藻藻際環境的細菌多樣性.生態學報,2015,35(5):1587- 1600.

Miao Z, Du Z J, Li H R, Lou Y Y, Luo W.Analysis of bacterial diversity in the phycosphere of five Arctic microalgae.Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1587- 1600.