糖尿病性和老年性白內障晶狀體上皮細胞凋亡與Fas、Bax基因的表達

郜青葉，王心淼，金子夜

(內蒙古醫科大學附屬人民醫院眼科,呼和浩特 010010)

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·論著·

糖尿病性和老年性白內障晶狀體上皮細胞凋亡與Fas、Bax基因的表達

郜青葉，王心淼，金子夜

(內蒙古醫科大學附屬人民醫院眼科,呼和浩特 010010)

[摘要]目的探討糖尿病性白內障及老年性白內障晶狀體上皮細胞(LECs)的凋亡與Fas、Bax基因的關系。方法在白內障超聲乳化手術中取糖尿病性及老年性白內障患者的晶狀體前囊膜標本45例，應用光鏡，電鏡觀察LECs的凋亡情況，應用RT-PCR定量檢測Fas蛋白，Bax蛋白在白內障LECs中的表達。結果兩種白內障患者的LECs呈透明樣變性，細胞內有空泡(糖尿病性白內障LECS可見增生重疊)，細胞多呈扁平狀，大小不均，核固縮，染色質凝聚邊緣化。糖尿病性白內障LECs除可見凋亡小體之外，上述改變較老年性白內障更為嚴重。兩種白內障LECs中均有Fas、Bax蛋白表達。Fas蛋白在糖尿病性白內障LECs中的表達平均是老年性白內障的13.34倍，Bax蛋白在糖尿病性白內障LECs中的 表達平均是老年性白內障的38.12倍，差異有統計學意義(P<0.05)。結論兩種白內障LECs均出現凋亡，Fas、Bax基因在白內障LECS凋亡中起重要作用。

[關鍵詞]白內障；基因表達;超聲乳化白內障吸除術；上皮細胞

隨著全球人口老齡化，特別是糖尿病患者發病率不斷上升，白內障的發病率也日趨增高。近年來，許多學者認為，晶狀體上皮細胞(LECs)凋亡是非先天性白內障發病共同的細胞學基礎，但LECs凋亡及其凋亡相關基因在白內障發展過程中的具體生物學機制尚不清楚[1-2]。目前認為Fas、Bax是促進細胞凋亡的重要基因。我們應用RT-PCR定量檢測Fas、Bax在兩種不同類型的白內障LECs中的表達，進一步探討Fas、Bax蛋白在白內障細胞凋亡中的作用，為今后在控制細胞凋亡水平、預防白內障方面提供實驗依據。

1對象與方法

1.1研究對象收集2012年5月至2014年5月在我院行白內障超乳手術的白內障患者43例(45眼)，其中糖尿病患者22例(23眼)，年齡53~85歲(平均69.98歲)，糖尿病病史5年以上(合并視網膜增殖性病變3例)大于白內障病史。入院前內科已確診為2型糖尿病，術前空腹血糖控制在8.3 mmol/L以下，尿糖轉陰。老年性白內障21例(22眼)，年齡55~82歲(平均年齡68.5歲)，排除其他眼疾引起白內障的因素，白內障術前診斷標準：視力小于0.4(裸眼、矯正)，晶狀體混濁(核2~4級)，在“超乳”手術中由同一位術者完成連續環形撕囊取得中央部晶狀體前囊膜標本，直徑>5 mm。將糖尿病性和老年性白內障患者的晶體前囊膜標本各5例做逆轉錄PCR(RT-PCR)監測，其余樣本做光鏡及電鏡檢測。

1.2方法

1.2.1光鏡標本制作取下晶狀體前囊膜標本，緩沖液沖洗干凈，平鋪于載玻片，濾紙吸除水分，干燥5 min，10%中性甲醛固定1 h，蘇木素伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2電鏡標本制作快速取材切成1 mm3小塊，放入裝有3%戊二醛的小瓶內前固定2h；然后經PBS漂洗3次，每次15 min；經1%四氧化鋨后固定1 h；經PBS漂洗3次，每次15 min；經50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%梯度脫水，各濃度脫水時間15 min；經浸透劑浸透、包埋劑包埋、聚合、修快、超薄切片、醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙染色后上鏡觀察。

1.2.3RT-PCR定量檢測把晶狀體前囊膜標本放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣本呈粉狀后加入Trizol總RNA提取試劑保存5 min加氯仿0.2 mL，用力震蕩，離心管充分混勻，室溫下放置5~10 min，用Trizol法提取總RNA，采用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，然后采用PrimlscripttmRT.reayent.Kit.withgDNA.Eraser進行cDNA反轉錄，將各樣品cDNA十倍稀釋后取2 μL做模板分別用于目的基因引物和內參基因引物進行擴充，同時在60~95℃進行溶解曲線分析，取5 μLRNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠自動成像儀保存圖像并定量分析，根據Real Time PCR原始檢測結果按照2-△△ct相對定量計算公式計算出各樣品的目的基因相對定量結果即其他各樣品相對于對照樣品的基因mRNA轉錄水平的差異。

1.3統計學處理使用SPSS13.0統計軟件處理數據，計量資料采用兩樣本均數t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1鏡下檢查結果光鏡下觀察白內障LECs呈透明樣變性，細胞內可見空泡，糖尿病性白內障LECs有增生重疊現象[3]。電鏡下兩種白內障患者LECs細胞形態大小不一，以扁平狀為主，內質網空泡變性，核固縮，胞漿濃縮，核膜皺褶呈不規則形，染色質分布不均勻，凋亡細胞與晶體囊膜結合疏松，有部分脫離。糖尿病性白內障LECs中可見凋亡小體，白內障LECs中未見到凋亡小體，糖尿病性LECs凋亡情況比老年性白內障更為嚴重。

2.2各基因擴增的標準曲線選取樣本cDNA進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增，同時在60~95℃進行融解曲線分析，儀器自動繪制出對應的內參基因標準曲線和目的基因的標準曲線。各標準曲線的R2均達到0.99，說明線性相光度很高,且擴增效率均在90%以上，因此可采用此種方法和上述引物進行后續樣本的擴增分析。

2.3目的基因相對定量結果根據RealTimePCR原始檢測結果，按照2-△△ct相對定量計算公式，計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉錄水平的差異，結果數據見表1。

表1　各樣品的目的基因相對表達量

從表1中分析可以看出，糖尿病患者白內障晶狀體前囊膜樣本中Fas與Bax基因的表達顯著高于老年性患者，說明糖尿病患者白內障晶狀體前囊膜的細胞衰老程度相比老年性患者更加嚴重[4]。由于個體差異原因，在同一種疾病的患者群體里，Fas與Bax基因分別表達的量并不一致，但從群體角度分析，糖尿病患者的表達量顯著高于老年性患者(P<0.05)。因此，我們可以得出結論，糖尿病患者的白內障受損程度顯著高于老年性患者。

3討論

目前有許多新技術新方法從形態學觀察細胞凋亡的變化，本實驗電鏡下觀察到凋亡細胞體積縮小變形大多呈扁平狀，與晶體囊膜脫離，與周圍細胞間隙增大，線粒體腫大，細胞密度增加，核質濃縮，染色質分布不均，可見凋亡小體。糖尿病性白內障LECs細胞凋亡情況比老年性更為嚴重[5]。

Fas、Bax蛋白在促進白內障晶體上皮細胞凋亡中起重要作用，目前LECs導致白內障的發生已是人們關注的熱點，但從客觀上來說，對細胞凋亡過程中信號傳遞系統的認識還不夠全面，比較清楚的通路有細胞凋亡的膜受體通路、細胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學通路[6]。Fas是一種跨膜蛋白[7]，與天然配對的Fasl結合，首先Fasl誘導受體三聚體化，然后再細胞膜上形成凋亡誘導復合物，內含帶有死亡結構域的Fas相關蛋白FADD，它是死亡信號轉錄中的一個連接蛋白，由兩部分組成，C端(死亡結構域即DD結構域)和N端(DED，死亡效應結構域)，DD結構域負責和Fas分子胞內段上的DD結構域結合，再以DED和Caspases8原域中的DED相互作用，聚合多個Caspases8分子，該分子隨由單鏈酶原轉化成有活性的單鏈蛋白Caspases，它作為酶原被激活后，可直接破壞細胞結構。滅活或者下調與DNA修復相關的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯蛋白，由于這些蛋白功能被抑制，使細胞的增值與復制受阻并發生凋亡。Bax蛋白是BC1-2家族中參與細胞凋亡的成員，當誘導凋亡時，它從胞液遷移到線粒體和核膜。在RT-PCR檢測中，糖尿病性白內障LECs中Fas蛋白相對定量平均是老年性白內障LECs中的13.22倍[8]，Bax蛋白在糖尿病性白內障LECs中的相對定量平均是老年性白內障LECs中的38.3倍[9],差異有統計學意義(P<0.05)，提示Fas蛋白與Bax蛋白介導的細胞凋亡在白內障的形成中起著重要作用，特別是合并增值性視網膜病變的糖尿病性白內障中更為顯著[10]，電鏡下也證實糖尿病性白內障的凋亡情況比老年性白內障更為嚴重。

本實驗結果提示我們糖尿病性白內障LECs發生凋亡的過程中可能有促進Fas、Bax蛋白介導細胞凋亡的因素[11]，如果這一因素被發現，就可以抑制Fas、Bax蛋白介導細胞凋亡，減少和預防白內障的發生;為今后藥物治療白內障提供一個新思路。

參考文獻

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Diabetic cataracts and senile cataract lens epithelial cell apoptosis and the expression of Fas,Bax gene

GaoQingye，WangXinmiao，JinZiye

(DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedPeople′sHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege，Huhhot010010，China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the relationship between lens epithelial cells (LECs) apoptosis of the diabetic cataract and senile cataract and the expression of Fas,Bax.MethodsForty-five cases were selected from diabetic and senile patients' anterior lens capsules specimens,using light and electron microscopic to observe apoptosis of LECs,and applying RT-PCR to quantitatively detect expression of Fas and Bax in cataract LECs.ResultsThe two LECs of cataract patients were hyaline degeneration.Cells had vacuoles.(The diabetes cataract LECS visible proliferation overlap).Cells were mostly flat,uneven size,nuclear pyknosis,marginalization of chromatin condensation.In LECs of diabetic cataract,these changes above of diabetic cataract even more serious than those in senile cataract.Two kinds of cataract in the LECs had both protein expression of Fas and Bax.Fas protein expression in diabetic cataract LECs was 13.34 times as high as senile cataract.Bas protein expression in diabetic cataract LECs was 38.12 times as high as senile cataract.and significant differences was found between them(P<0.05).ConclusionThe typical apoptosis was observed in two kinds of cataract LECs.Fas and Bax genes play an important role in cataract LECs apoptosis.

[Key words]Cataract；Gene expression;Phacoemulsification；Epithelial cells

(收稿日期：2015-01-22)

Corresponding author：Jin Ziye,Email:jinziye1987@126.com

中圖分類號：R776.1

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.03.006

通信作者:金子夜，醫師，Email:jinziye1987@126.com

作者簡介：郜青葉，主任醫師，教授，碩士生導師，Email:13347101200@163.com

基金項目：內蒙古自治區科技廳基金資助(20110501)