17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響

陳美霓，郭巍，趙菊梅，魏曉麗

(1.延安大學醫學院實驗中心，延安 716000 ；2.延安大學醫學院附屬醫院泌尿外科)

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·基礎研究·

17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響

陳美霓1，郭巍2，趙菊梅1，魏曉麗1

(1.延安大學醫學院實驗中心，延安 716000 ；2.延安大學醫學院附屬醫院泌尿外科)

[摘要]目的觀察17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素(17-AAG)對肝癌HepG2細胞增凋亡的影響,并探討其機制。方法采用吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)熒光染色，通過熒光顯微鏡觀察HepG2細胞凋亡情況；采用流式細胞儀分析細胞凋亡率的變化；逆轉錄聚合酶鏈反應檢測17-AAG處理肝癌HepG2細胞前后bax和bcl-2的mRNA蛋白表達。結果AO/EB熒光染色結果顯示對照組呈均勻綠色熒光，實驗組隨著藥物濃度的增加，呈紅色熒光凋亡細胞逐漸增多；流式細胞儀結果顯示17-AAG促進肝癌HepG2細胞凋亡；RT-PCR結果顯示17-AAG能使bax的mRNA蛋白表達水平升高、bcl-2的mRNA蛋白表達水平下降，其作用呈劑量效應關系。結論17-AAG具有促進肝癌HepG2凋亡作用，其機制可能與其上調bax、下調bcl-2蛋白表達有關。

[關鍵詞]肝腫瘤;Hep G2細胞;細胞凋亡;bcl-2相關X蛋白質;bcl-X蛋白質

WHO癌癥研究中心(IARC)統計，2008年肝癌是全球第5位常見癌癥，其病死率占所有癌癥死亡率的第3位[1]。17-丙烯胺-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)是熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑，對多種腫瘤細胞具有抑制生長、誘導凋亡的作用。本文通過體外實驗探討17-AAG對HepG2細胞凋亡的作用，并通過檢測bax和bcl-2mRNA蛋白的變化對其作用機制做了初步研究。

1材料和方法

1.1材料(1)實驗細胞：人肝癌細胞株HepG2由延安大學醫學院實驗中心實驗室提供。(2)主要試劑：RPMI-1640培養基(賽默飛世爾公司)，17-AAG、氮唑藍、二甲亞砜及碘化丙啶(美國Sigma公司)，AnnexinV FITC細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD pharmingen 公司)，Trizol(南京凱基生物技術有限公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，Bcl-2、Bax、β-actin引物由上海生工設計合成，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(中國Fermentas 公司)。(3)主要儀器：熒光倒置顯微鏡及CCD(日本Nikon)，凝膠成像系統GENE(英國Syngene公司)，流式細胞儀FACS Calibur(美國Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養人肝癌HepG2細胞于RPMI-1640培養液中培養，內含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置37 ℃、5%CO2培養箱中。實驗選取對數生長期細胞進行研究。實驗設健康對照組和實驗組，血清濃度均為5%，實驗組17-AAG濃度為0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L。

1.2.2吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙重熒光染色觀察細胞形態取對數生長期的HepG2細胞，以2×105/mL的密度接種于內有干凈無菌蓋玻片的6孔板中24 h后，加入含藥培養基，并設對照組。培養48 h后棄培養液，PBS 洗滌3次后滴濃度為100 μg/mL的 AO/EB混合液于爬片上30 s，夾出蓋玻片置于載玻片上，用波長為490 nm處的熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡率將HepG2細胞制成細胞懸液以2×105/mL的密度接種6孔板內，細胞貼壁后設實驗組和對照組作用48 h，胰酶消化離心收集細胞，按照AnnexinV FITC細胞凋亡檢測試劑盒使用說明染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)收集實驗組和對照組處理48h的HepG2細胞，按照Trizol試劑盒說明書操作提取總RNA,取少量樣品用紫外分光光度儀在A260nm/A280nm處測定其濃度和純度，并合成cDNA，合成樣品于-80 ℃保存。取cDNA反應原液2 μL，DEPC水39 μL，dNTP 1 μL，10×PCRbuffer 5 μL，上游、下游引物各1 μL，Taq聚合酶1 μL，總體積為50 μL。PCR反應條件：預變性為94 ℃ 3 min，30個循環程序為94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃60 s，72 ℃延伸5 min。引物序列、大小及退火溫度見表1。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，以β-actin 作為內對照，用凝膠成像系統進行拍照及圖像分析。

表1　被檢測基因所使用的引物序列

1.3統計學處理采用SPSS17.0統計軟件包進行分析，各組間差異比較采用t檢驗。

2結果

2.1吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)雙重熒光染色觀察細胞形態17-AAG作用于HepG2細胞48 h后對活細胞進行AO/EB雙染染色顯示，健康對照組細胞可見細胞核呈綠色熒光，細胞核形態完整，大小一致，著色均勻；實驗組可見凋亡細胞和死亡細胞。凋亡細胞核呈染色增強，均勻一致固縮狀或片段狀的紅色熒光，死亡細胞核形態結構正常，呈橘紅色熒光。隨著藥物濃度的增加，可見細胞數逐漸減少，凋亡細胞和死亡細胞逐漸增多，見圖1。

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡率流式細胞術分析顯示，HepG2細胞在17-AAG作用48 h后，細胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高，與對照組凋亡率比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2　17-AAG作用HepG2細胞48 h的凋亡率(n=4)

注：與對照組比較,aP<0.05

2.3RT-PCR檢測bax和bcl-2的mRNA表達RT-PCR結果顯示，與健康對照組比較，17-AAG作用的HepG2細胞中bax mRNA表達隨著藥物濃度的增加而增加，bcl-2 mRNA表達逐漸減少，bax和bcl-2的mRNA表達具有劑量相關性，實驗組不同濃度藥物對HepG2細胞bax和bcl-2 mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)，見表3，圖2。實驗組17-AAG濃度為0.63、1.25、2.5、5.0μmol/L的bcl-2/ bax比值分別為0.701、0.551、0.474、0.433，均低于健康對照組的比值1.366，呈一定的劑量關系。

表3　HepG2細胞的bax、bcl-2 mRNA表達水平

注：與對照組比較，aP<0.05

3討論

HSP90是眾多熱休克蛋白的一種，是細胞內最活躍的分子伴侶蛋白之一，在應激條件下維持細胞必需的蛋白質空間構象保護細胞生命活動，它具有特殊的分子伴侶功能[2-3]。HSP90在眾多腫瘤中呈高表達狀態，并隨著腫瘤侵襲逐漸加深，HSP90的表達也逐步增加[4]。而腫瘤細胞中的HSP90過表達、蓄積，幾乎控制了所有惡性細胞表型組成成分及細胞信號傳導通路[5]。HSP90還參與腫瘤血管的生長侵襲及轉移，在藥物耐受﹑增加腫瘤細胞輻射敏感性及抗凋亡信號通路活化等起重要作用[6-8]。Hsp90已經成為腫瘤治療的新靶點[9]。

17-AAG是HSP90特異抑制劑。研究證實17-AAG能與腫瘤來源的HSP90靶向結合，優先殺死腫瘤細胞，同時通過阻斷多個信號通路的多個靶點，使腫瘤細胞周期停滯、誘導凋亡，并且可以增加腫瘤對其他化療藥物的敏感性[10-11]。本實驗發現AO/EB雙重熒光染色下，17-AAG處理的HepG2細胞可見體積小、核濃縮、強熒光的紅色凋亡小體，隨著藥物濃度的增加，凋亡小體也逐漸增多，并出現細胞核形態正常的橘紅色死亡細胞。經細胞流式儀檢測結果證實，17-AAG有誘導人肝癌HepG2細胞凋亡，隨著時間延長，凋亡作用明顯增強的作用。

細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，是多基因嚴格控制的過程。其中bcl-2家族是細胞凋亡的重要調節因子，其中bax與bcl-2是一對互相拮抗的蛋白。bcl-2蛋白屬于線粒體蛋白，通過阻止線粒體里細胞色素C 釋放，抑制caspase蛋白酶的活化[12]；同時抑制Ca2+的跨膜流動，抑制PT孔的開放[13]，從而抑制細胞凋亡。bax蛋白通過二聚體形式改變線粒體膜的通透性，誘導細胞凋亡[14]。本次試驗RT-PCR結果顯示，不同濃度的17-AAG作用HepG2細胞后，bax蛋白的表達隨著藥物濃度的上升而上調，而bcl-2蛋白則相反。有實驗研究表明，Bax和bcl-2可以形成同源或異源bcl-2/bax二聚體，其比值增大時抑制細胞凋亡，當比值減小時加速細胞凋亡[15]。本研究表明，17-AAG作用HepG2細胞后，可隨藥物濃度的增加而降低bcl-2/bax的比值，從而促進HepG2細胞的凋亡。

綜上所述，HSP90抑制劑17-AAG能誘導HepG2細胞發生凋亡，其機制可能上調bax蛋白的表達、下調bcl-2蛋白的表達，并同時下調bcl-2/bax比值有關。

(本文圖1,2見插圖1-1)

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Effects of 17-allylamino-17-demethoxygelda-namycin(17-AAG) on apoptosis of human hepatoma carcinoma cell lines HepG2 in vivo

CHENMeini*,GUOWei,ZHAOJumei,WEIXiaoli

(*CenterofMedicalExperiment,Yan'anMedicalCollege,Yan'anUniversity,Yan'an716000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the influence of 17-allylamino-17-demethoxygelda-namycin(17-AAG) on cell apoptosis of Human hepatoma carcinoma cell Lines HepG2,and explore the possible mechanism.MethodsCellular morphological alterations were observed after AO/EB staining;the apoptosis and cell cycle of HepG2 cells were assayed by flow cytometry;the expression of apotosis related proteins bax and bcl-2 in HepG2 cells treated with 17-AAG were detected by RT-PCR．ResultsThe result of AO/EB double staining showed that the control homogeneously were green fluorescence;the experimental group were red fluorescent,and the red fluorescent was increased with drug concentration gradually;Flow cytometry result showed 17-AAG promote hepatocellular carcinoma HepG2 cell apoptosis;RT-PCR results showed that 17-AAG can increased bax mRNA expression levels of protein,decreased the BCL-2 mRNA protein expression levels,the effect was related with drug dose.Conclusion17-AAG can inhibit proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells,and the mechanism may be related to its effect in up-regulating bax protein expression and down-regulating the BCL-2 protein expression.

[Key words]Liver neoplasms;Hep G2 Cells;Apoptosis;bcl-2-Associated X Protein;bcl-X Protein

(收稿日期：2014-08-22)

Corresponding author:GUO Wei，Email:15756560@qq.com

中圖分類號：R735.7

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.016

通信作者：郭巍，主治醫師，Email：15756560@qq.com

作者簡介：陳美霓，實驗師，Email：25677435@qq.com

基金項目：陜西省教育廳科學研究項目(12JK0713)；延安市科學技術研究發展計劃項目(2013-KW15)； 2012年延安大學自然科學專項基金項目