肝癌組織乙酰肝素酶的表達及其與微血管密度的關系

楊其容，張平安

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是發病率較高的惡性腫瘤，具有侵襲能力強、極易發生轉移等特點。肝癌細胞侵犯門靜脈系統，導致肝組織內播散是術后疾病復發率高的原因之一[1]。相關研究證實[2，3]，肝癌侵襲周圍組織和發生遠處轉移等現象主要是因為腫瘤細胞突破細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）和血管基底膜（Basement membrane，BM）及腫瘤組織內新生血管組織的形成。乙酰肝素酶（Heparanase，Hpa）是一種內切糖苷酶，可對ECM和BM的結構完整性造成嚴重破壞，進而有助于腫瘤細胞順利通過ECM和血管壁，最終出現周圍組織侵襲和遠處臟器轉移[4～7]。本研究檢測了HCC組織Hpa的表達情況，并分析了其與微血管密度（Microvessel density，MVD）的相關性。

1 資料與方法

1.1 組織來源 47例原發性肝癌組織標本均取自本院2012年7月至2014年12月期間行外科手術切除的HCC患者，經組織病理學檢查確診為HCC。所有患者手術治療前均未采取放化療措施，且局部淋巴結在手術治療中均得到清除。同時切除同一患者第一份癌旁肝組織（距病灶組織邊緣2 cm處）作為A組和第二份癌旁肝組織（距病灶組織邊緣>5 cm）作為B組。

1.2 試劑 Trizol試劑購自Promega公司；逆轉錄酶、Taq酶和dNTP均購自北京中山生物技術有限公司；Hpa上下游引物及β-actin由上海生工生物工程公司合成；抗Hpa和抗CD34兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司；S-P免疫組化試劑盒及二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 肝癌組織Hpa蛋白和CD34表達水平檢測 將手術取出的肝癌組織置入4%多聚甲醛溶液固定、95%酒精溶液脫水及石蠟包埋，由病理科醫生制作4μm厚切片，采取免疫組織化學法（SP法）檢測Hpa蛋白和CD34表達，即組織切片經脫臘至水，高溫修復抗原，0.3%H2O2溶液阻斷內源性過氧化酶。采用羊血清封閉處理內源性抗原，滴加抗Hpa或抗CD34兔抗人多克隆抗體（1:500）及相應的二抗，DAB顯色，予以復染、脫水、透明及封片。以0.1%PBS溶液替代一抗作為陰性對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。結果判斷：Hpa蛋白主要表達在肝癌細胞的胞漿中，根據下列標準判斷陽性細胞率和染色強度：① 陽性細胞率：0分，≤5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>75%；② 染色強度：0分，無色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細胞率×染色強度≥2分表示為Hpa蛋白檢測陽性。

1.4 MVD值測定 采用抗CD34抗體對肝癌組織內的血管內皮細胞進行標記，在光學顯微鏡下計算單位面積內微血管數目，即為MVD值。首先，在低倍鏡下選定最佳檢測區域，然后在200倍顯微鏡下隨機選擇4個視野，內皮細胞經免疫組化法染色呈棕黃色表現時計數為一個血管，而血管管腔>8個紅細胞，或血管管壁有平滑肌組織表現時則不作為一個血管進行計數。其平均值即為MVD值。

1.5 各種肝組織Hpa mRNA水平檢測 采用RTPCR法檢測。稱量新鮮肝組織100 mg，完全研磨成粉末狀后轉移至勻漿器中，加入Trizol試劑1 ml，提取RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA水平。稱量總RNA 2μg，37℃逆轉錄處理60 min。PCR反應條件為：94℃變性處理 5 min；94℃60 s，57℃60 s，72℃60 s，72℃延伸 5 min，共 30 個循環。根據已知Hpa的基因序列設計引物，上游引物：5'-TTCGAT CCCAAGAAGGAATCAAC-3'，下游引物：5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3'，PCR擴增產物為 585b；β-actin上游引物：5'-ATCTGGCAC CACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3'，下游引物：5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'，PCR擴增產物為838 bp。將PCR反應產物與緩沖液按1:1比例進行混合，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應用紫外凝膠成像分析系統（上海迪奧生物科技有限公司）掃描PCR條帶的光密度，從而獲得目的片段擴增條帶的平均灰度值，以Hpa/β-actin比值表示Hpa mRNA的相對水平。

1.6 統計學分析 應用SPSS 13.0軟件包，計數資料比較采用卡方檢驗，計量資料以（）表示，采用t檢驗，對Hpa mRNA水平與MVD的相關性采用Spearman法分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床和病理學特征肝癌組織Hpa蛋白表達的比較 Hap蛋白主要定位在肝癌細胞胞漿內，呈棕黃色顆粒狀及彌漫性片狀分布（圖1、圖2）。不同分化程度、臨床分期、轉移復發、AFP水平、有無門脈癌栓和不同腫瘤直徑癌組織中Hpa蛋白表達存在明顯的差異（P<0.05，表 1）。

2.2 各組肝組織Hpa mRNA和MVD水平 比較CD34在肝癌組織中呈彌漫性分布，而在正常肝組織肝竇內無CD34表達，或僅在少數匯管區血管有所表達（圖3、圖4、圖5），肝癌組織Hpa mRNA和MVD水平均明顯高于A組和B組（P<0.05），而A組Hpa mRNA和MVD水平明顯高于B組（P<0.05，表 2）。

表1 不同臨床和病理學特征肝癌組織Hpa蛋白表達的比較

圖1 肝癌組織Hpa蛋白表達陽性(SP，200×)

表2 各組肝組織Hpa mRNA水平和MVD個數（）比較

表2 各組肝組織Hpa mRNA水平和MVD個數（）比較

與肝癌組織比，①P<0.05；與A組癌旁組織比，②P<0.05

例數 Hpa/β-actin MVD（個）肝癌組織 47 0.793±0.184 34.5±12.2 A組癌旁組織 47 0.577±0.145① 22.2±10.7①B組癌旁組織 47 0.384±0.117①② 14.7±7.4①②

3 討論

周圍組織侵襲和遠處臟器組織轉移均為惡性腫瘤疾病的病理特征，也是影響腫瘤患者治療效果和疾病預后的重要因素。腫瘤細胞對ECM和BM的侵襲破壞、新生血管組織的形成是腫瘤組織生長、轉移的重要條件，而ECM和BM主要由結構蛋白和糖氨聚糖構成，后者主要成分為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）[8，9]。相關研究顯示[10，12]，HSPGs在胚胎組織早期形成、形態形成、血管組織生成和上皮間質細胞相互作用等方面均發揮極為關鍵的生理學作用。

圖2 肝癌組織Hpa蛋白表達陰性(SP，200×)

近些年，關于HCC轉移主要集中在底物為結構蛋白的蛋白酶上，而對底物為HSPGs的Hpa研究相對較少。Hpa mRNA可出現在脾臟、骨髓等免疫組織中，而在心肺肝腎等非免疫組織中均不存在，但可廣泛存在于惡性腫瘤組織或細胞中[13,14]。相關研究結果顯示[15]，Hpa可特異性降解HSPGs，在各種病理生理過程中均起到一定的作用，而其水平降低后誘發的效應作用主要為[16]：①在ECM、BM降解后，阻礙癌細胞發生轉移的保護屏障系統也會受到嚴重損傷；②結合在Hpa上的堿性成纖維細胞生長因子大量釋放，進而促進血管內皮細胞的增殖；③ 結合在Hpa上的uPA和tPA大量釋放，進而活化生長因子和激活ECM中的蛋白酶級聯反應。上述效應作用在腫瘤細胞的生長增殖及周圍組織侵襲等病理過程中起著明顯的促進作用。相關研究已證實[17]，Hpa表達與多種惡性腫瘤的生長﹑浸潤和轉移等病理現象均存在緊密的相關性，但其在肝癌組織中的表達研究相對較少。本研究結果顯示，Hpa蛋白在分化程度、臨床分期、轉移復發、AFP、門脈癌栓、腫瘤直徑等不同臨床病理特征方面均存在明顯的差異性（P<0.05）。轉移復發的肝癌組織中Hpa蛋白表達陽性率明顯高于未發生轉移復發的肝癌組織，分析原因主要是肝癌細胞破壞ECM和BM，極易突破門靜脈血管管壁，進而沿著門靜脈屬支發生遠處臟器組織轉移[18]。低分化及臨床分期高的肝癌組織Hpa蛋白表達陽性率明顯高于高分化及臨床分期低的肝癌組織，提示分化程度越低及臨床分期越高，則腫瘤組織的周圍組織侵襲力越高，可能與低分化和高臨床分期肝癌組織中Hpa蛋白表達水平較高有一定的相關性[19]。有門脈癌栓表現的肝癌組織Hpa蛋白表達陽性率明顯高于無門脈癌栓者，門脈癌栓是反映肝癌細胞侵襲周圍組織能力的重要特征，而肝癌細胞侵入門靜脈系統形成癌栓的主要原因是Hpa降解和破壞正常組織的保護屏障系統[20]。

腫瘤病灶組織內新生血管組織的形成是導致腫瘤生長、浸潤、轉移等病理過程的重要因素，分析原因是新生血管為腫瘤細胞增殖生長提供了充足的營養物質，且為其周圍組織浸潤、遠處臟器組織轉移提供了有效通道。MVD是反映新生血管形成及腫瘤細胞浸潤、轉移等能力的有效指標，而CD34明顯優于其他標記物，故本研究采用CD34標記計算各組肝組織的MVD值[21]。本研究結果顯示，肝癌組織Hpa mRNA水平及MVD值均明顯高于癌旁組織和正常肝組織，且Hpa mRNA水平與MVD值呈正相關，此結果提示Hpa可促進腫瘤組織新生血管的形成。

綜上所述，Hpa蛋白在肝癌細胞生長增殖、周圍組織侵襲和新生血管形成等病理過程中起著關鍵性的作用，可成為臨床治療肝癌的新作用靶點。由于Hpa蛋白表達與部分肝癌臨床病理特征有一定的相關性，對指導臨床治療和預后評估具有一定的價值。

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