嬰兒雙歧桿菌發酵培養的改進研究

沈頤涵

（上海信誼藥廠有限公司制藥總廠，上海201206）

0 引言

雙歧桿菌是人體消化道內具有益生作用的優勢菌群，迄今為止已發現的雙歧桿菌有32種，其中分離自人體的有12種。雙歧桿菌作為人體消化道中的原生菌以及其微生態制品所具有的特有性質，使其備受學術界和商界的關注[1]。

目前，可用于保健食品的雙歧桿菌主要有5種：兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長型雙歧桿菌、短雙歧桿菌和青春雙歧桿菌[2]。已見報道的雙歧桿菌的生理功能包括：調整腸道菌群[3-4]、增強免疫系統[5]、防止便秘、降低結腸癌的發病率[6]、產生抗菌素[7]、提高蛋白質和維生素的代謝、緩解乳糖不耐癥、治療肝損傷、抗腫瘤、降低膽固醇[8]等。

雙歧桿菌類產品主要有食品、保健品和藥品等，而在此類產品的開發中，由于雙歧桿菌對生存環境的要求較為苛刻，使其高密度培養成為限制工業化生產的瓶頸。因此，如何縮短培養時間并提高發酵液活菌數就成為了技術關鍵。在我廠目前的工藝條件下，嬰兒雙歧桿菌的發酵液活菌數為8.0×109cfu/g左右。

本研究通過優化發酵培養控制參數，旨在提高發酵液活菌量，為今后嬰兒雙歧桿菌的擴大培養和工業化應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

菌種：嬰兒雙歧桿菌（B.infantis）由上海信誼藥廠有限公司藥物研究所微生態制品研究室保藏。

培養基配方：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、牛肉膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、乳糖10 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸亞鐵0.05 g/L、L-半胱氨酸0.25 g/L。

1.2 儀器設備

5 L發酵罐及配套系統（上海國強生化工程裝備）；GQ75B高速管式離心機（上海浦東天本離心機械）；培養箱（Binder）；PHS-3E型精密pH計（上海雷磁）；Cary50紫外分光光度計（Varian）；BP3100S電子分析天平（Sartorius）；滅菌鍋（Tony）；厭氧產氣袋（梅里埃）。

1.3 試驗方法

采用5 L發酵罐進行發酵研究，裝罐量為3 L，分別研究發酵溫度、發酵pH值、攪拌轉速以及發酵時間對發酵液中活菌數量的影響，活菌量以lg活菌數值表示。

1.3.1 發酵液活菌數的測定

采用血瓊脂平板計數法，梯度稀釋至約菌數20～160個/mL后涂平板，置于（37±1）℃培養箱內進行厭氧培養48 h后計數。

1.3.2 發酵溫度對發酵液活菌數的影響

嬰兒雙歧桿菌按質量分數10%接種量接入發酵罐培養，調節pH值為6.0，轉速200 r/min，分別置于32℃、35℃、37℃、39℃、42℃溫度下發酵10 h，發酵結束后放罐，檢測發酵液活菌數。

1.3.3 發酵pH值對發酵液活菌數的影響

按照1.3.2所確定的最適合發酵溫度，將嬰兒雙歧桿菌接種于pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的發酵培養基內，在轉速為200 r/min的條件下發酵10 h，發酵結束后放罐，檢測發酵液活菌數。

1.3.4 攪拌速度對發酵液活菌數的影響

按照1.3.2和1.3.3所確定的最適合發酵溫度和pH值，將嬰兒雙歧桿菌分別在200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min的攪拌速度下發酵10 h，發酵結束后放罐，檢測發酵液活菌數。

1.3.5 發酵時間對發酵液活菌數的影響

按照1.3.2、1.3.3和1.3.4所確定的最佳發酵參數，發酵嬰兒雙歧桿菌，每2 h取發酵液，分別測定其活菌數，繪制嬰兒雙歧桿菌的生長曲線，確定該菌的最佳發酵時間。

2 結果與分析

2.1 發酵控制參數的選擇

2.1.1 發酵溫度對發酵液活菌數的影響

發酵過程中，溫度對微生物的生長有著較為重要的影響。一般提高溫度，能夠加速細胞分裂，使微生物的生長速度加快，但過高的溫度會對微生物的生長起到抑制作用。本實驗中，嬰兒雙歧桿菌按10%的接種量，在pH值6.0、攪拌轉速200 r/min、溫度分別為32℃、35℃、37℃、39℃、42℃的條件下厭氧發酵10 h，發酵液的活菌數結果如圖1所示。

圖1 不同發酵溫度下發酵液的活菌數

圖1 可以看出：發酵溫度對雙歧桿菌發酵液中活菌數的影響較為明顯，且在不同的溫度條件下，發酵液的菌落數存在差異。溫度升高超過37℃后，嬰兒雙歧桿菌的生長速度并未有明顯的提高。該菌株在37℃的條件發酵液中lg活菌數達到最高值9.38，折算成活菌數2.4×109cfu/mL，表明溫度37℃為嬰兒雙歧桿菌的最適發酵培養溫度。

2.1.2 pH值對發酵液活菌數的影響

在微生物發酵過程中，除了選擇合適的溫度外，維持發酵體系pH值的穩定也至關重要。本實驗中，嬰兒雙歧桿菌按10%的接種量，在37℃、攪拌轉速200 r/min、pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的條件下發酵10 h，發酵液的活菌數結果如圖2所示。

圖2 不同pH值條件下發酵液的活菌數

圖2 可以看出：發酵培養的pH值對嬰兒雙歧桿菌發酵液中活菌數的影響明顯，在pH6.5的條件下，發酵液菌體濃度最高，lg活菌數為9.77，折算發酵液活菌數約為5.84×109cfu/mL，表明pH值為6.5為嬰兒雙歧桿菌的最適發酵培養pH值。

2.1.3攪拌速度對發酵液活菌數的影響

嬰兒雙歧桿菌按10%的接種量，在37℃、pH值為6.5、攪拌轉速分別為200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min的條件下發酵10 h，發酵液的活菌數結果如圖3所示。

圖3 不同攪拌速度條件下發酵液的活菌數

圖3 可以看出：發酵罐的攪拌轉速對嬰兒雙歧桿菌發酵液中活菌數的影響明顯。攪拌轉速提升，發酵液活菌數反而隨之下降，這可能是因為嬰兒雙歧桿菌是厭氧菌，在發酵過程中需要厭氧環境。攪拌轉速的增加，一定程度上增加了發酵體系中的溶解氧，使該菌株的生長環境發生變化所致。本實驗在轉速為200 r/min條件下發酵液的lg活菌數最高達到9.93，折算活菌數為8.33×109cfu/mL，表明嬰兒雙歧桿菌的最適攪拌轉速為200 r/min。

2.1.4 發酵時間對發酵液活菌數的影響

嬰兒雙歧桿菌按10%的接種量，在37℃、pH值6.5、攪拌轉速200 r/min的條件下，試驗不同發酵時間的發酵液lg活菌數值，發酵液的活菌數結果如圖4所示。

圖4 不同發酵時間下發酵液的活菌數

圖4 可以看出：在上述優化的實驗條件下，發酵液的lg活菌數值在發酵前期隨時間的延長而增長，在培養10～12 h后達到最高值，隨后lg活菌數值增長緩慢。考慮到發酵液的lg活菌數在10 h之后變化不大，因此，選擇發酵培養的時間為10 h較好。發酵10 h的結果顯示，發酵液中活菌數可達約4.5×1010cfu/mL。

2.2 發酵控制參數的優化

為了確定其發酵培養的最佳控制參數，以發酵液的活菌數作為檢測指標，通過單因素篩選獲得的發酵控制參數設計正交試驗如表1所示，以期最大限度提高嬰兒雙歧桿菌的發酵液活菌量。

表1 發酵控制參數設計的正交試驗表

通過正交試驗，分析試驗結果（表2），綜合考察最終選擇最佳發酵控制參數方案為C1D2A2B2，即溫度37℃、pH6.5、攪拌轉速200 r/min、發酵時間10 h。

表2 試驗結果分析

為驗證正交試驗結果的可靠性，采用上述優化控制參數進行試驗，實際測得在優化發酵參數條件下，嬰兒雙歧桿菌的發酵液活菌量可達4.5×1010cfu/mL，表明正交試驗所得出的最佳發酵控制參數可行。

3 結語

經過對嬰兒雙歧桿菌的培養溫度、發酵pH值、攪拌轉速以及培養時間的研究，優化篩選出了其最佳的發酵控制參數。與現有工藝相比，發酵菌體的得率能夠提升約5.6倍。

本研究通過對嬰兒雙歧桿菌發酵特性的研究，有效提高了發酵液活菌濃度，為今后嬰兒雙歧桿菌的擴大培養和工業化應用提供了基礎。

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