慢性丙型肝炎患者HCV基因分型與HCV-RNA濃度和凝血功能關系的探討*

姜樹朋，李 艷，汪 明，喬 斌(武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060)

?

·論 著·

慢性丙型肝炎患者HCV基因分型與HCV-RNA濃度和凝血功能關系的探討*

姜樹朋，李 艷△，汪 明，喬 斌(武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060)

目的 探討慢性丙型肝炎病毒(HCV)患者基因分型與HCV-RNA濃度和凝血功能之間的關系。方法 選取該院HCV患者66例作為慢性HCV患者組，健康人群20例作為健康對照組。對該院66例HCV患者采用ABI3500dx基因測序儀進行外周血HCV-RNA基因分型檢測以及采用羅氏Light Cycler熒光定量PCR儀進行外周血HCV-RNA定量檢測，對該院66例HCV患者和20例健康體檢者進行凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、血漿纖維蛋白原(FIB)檢測。結果 在66例HCV患者中，分別檢測出1a、1b、2a、3a、3b 和6a 型6種病毒基因型，其中基因1型39例，非基因1型27例。不同HCV基因型患者血清HCV病毒濃度比較差異有統計學意義(P<0.05)。HCV基因1型和非基因1型之間比較，凝血功能差異均無統計學意義(P>0.05)；HCV基因1型和非基因1型分別與健康對照組比較，凝血功能差異均有統計學意義(P<0.05)。HCV-RNA濃度與PT、APTT、TT、FIB的相關性差異均無統計學意義，相關系數分別為0.020、0.002、-0.072、-0.088(P>0.05)；HCV-RNA低濃度組(<5.0×105U/mL)和高濃度組(≥5.0×105U/mL)之間凝血功能比較差異無統計學意義(P>0.05)；HCV-RNA低濃度組和高濃度組分別與健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 不同基因型HCV感染與血液中HCV的病毒濃度相關，基因1型患者HCV-RNA濃度高于非1型患者；HCV基因分型和RNA病毒濃度與凝血功能各項指標大小無關，但是HCV患者較健康人群凝血功能降低，對于HCV感染者有必要進行凝血功能檢查，以便了解HCV患者凝血功能狀態，防止出現嚴重的出血。

慢性丙型肝炎； HCV基因分型； HCV-RNA濃度； 凝血功能

肝臟不僅是人體代謝的重要器官，同時也是合成多種凝血因子的重要場所，當肝臟受損(如肝炎、肝臟纖維化、肝癌等)時，凝血因子合成減少，造成凝血時間延長，容易發生內臟出血，是導致患者死亡的重要原因之一。丙型肝炎病毒(HCV)感染是導致慢性肝病、肝臟纖維化、肝癌的常見原因。HCV由于其基因的高度變異，根據病毒株核苷酸序列的同源性差異，可將其分為不同的基因型。目前已知HCV至少可分為6型(HCV 1～6型)，各型又分為許多亞型(如1a、1b、2a、2b、3a等)。不同基因型的HCV對治療藥物(如聚乙二醇干擾素、利巴韋林)的敏感程度不同，確定HCV感染者基因型有助于臨床治療和合理用藥[1-2]。但是，關于HCV基因分型及病毒濃度與肝損傷之間關系不同的研究尚未得出統一的結論。本研究分析66例慢性丙肝患者HCV基因分型與HCV-RNA濃度、基因分型和凝血功能的關系，以及HCV-RNA濃度和凝血功能的相關性，進一步探討HCV基因分型、病毒濃度和肝組織損傷之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 慢性HCV患者組：選取2013年8月至2014年8月于本院住院診治的慢性HCV患者66例，男36例，女30例;年齡20～70歲，平均35歲，診斷符合2010年版《丙型肝炎防治指南》的標準。健康對照組：選取本院同時期健康體檢人群20例作為對照組,男10例，女10例;年齡20～70歲，平均39歲。

1.2 方法

1.2.1 HCV-RNA基因分型檢測 對慢性HCV患者HCV-RNA提取采用EDTA抗凝血漿TRIzol LS試劑提取法，提取后的RNA使用Thermo公司的RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒進行逆轉錄，逆轉錄引物為隨機引物；測序引物Forward primer 5′-TTA ACC ACA TCM RCT CCG TGT G-3′,Reverse primer 5′-GTA CCT GGT CAT AGC YTC CGT RAA-3′，使用ABI3500dx基因測序儀測序，并將所測序列與HCV-RNA參考序列AF009606、AF271632和AF139594等(NCBI GenBank)進行比對分析，得出檢測結果。

1.2.2 HCV-RNA濃度的測定 采用凱杰生物工程(深圳)有限公司提供的HCV核酸定量檢測試劑盒(定量檢測線性范圍：1.0×103～5.0×107U/mL)，在提取HCV-DNA后，使用羅氏Light Cycler熒光定量PCR儀進行檢測。當被測樣本中HCV-RNA濃度1.0×103～5.0×107U/mL，則測定結果有效，可直接報告相應的RNA濃度；當被測樣本中HCV-RNA>5.0×107U/mL時，結果報告為大于5.0×107U/mL，本研究HCV-RNA>5.0×107U/mL時，按5.0×107U/mL記錄；當被測樣本中HCV-RNA<1.0×103U/mL時，結果報告為小于1.0×103U/mL，本研究HCV-RNA<1.0×103U/mL時，按1.0×103U/mL記錄；當被測樣本結果無循環閾值，即Ct值時，結果報告為0.0 U/mL。

1.2.3 凝血功能檢測 采集慢性丙型肝炎患者及健康對照組枸櫞酸鈉抗凝血后，立即輕輕顛倒混勻，離心后，使用日本SYSMEX公司全自動凝血分析儀CA-7000及配套試劑進行凝血功能測定，即凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、血漿纖維蛋白原(FIB)4項。

2 結 果

2.1 HCV基因分型與HCV-RNA濃度 在66例慢性HCV患者中，分別檢測出1a、1b、2a、3a、3b 和6a 型6種病毒基因型，其中基因1型39例，非基因1型27例。不同HCV基因型患者血清病毒濃度(lg U/mL)比較：基因1型患者HCV-RNA濃度為6.83±0.84，非1型患者HCV-RNA濃度為6.24±1.33，P<0.05，兩者差異具有統計學意義，不同基因型HCV感染與血液中HCV的病毒濃度相關，基因1型患者HCV-RNA濃度高于非1型患者。

2.2 HCV基因分型與凝血功能 見表1。HCV基因1型與非基因1型之間比較，即不同HCV基因型之間凝血功能的差異無統計學意義(P>0.05)。在20例健康對照組中，凝血功能檢測結果：PT為(10.72±0.50)s，APTT為(24.30±2.13)s，TT為(18.0±1.09)s，FIB為(3.03±0.51)g/L。HCV基因1型和非基因1型兩組分別與健康對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 HCV基因1型與非基因1型凝血功能比較±s)

2.3 HCV-RNA濃度與凝血功能 HCV-RNA濃度與PT、APTT、TT、FIB的相關性差異均無統計學意義，相關系數分別為0.020、0.002、-0.072、-0.088(P>0.05)。見表2。HCV-RNA高、低濃度組比較，即不同HCV-RNA濃度組之間凝血功能的差異無統計學意義(P>0.05)。HCV-RNA低濃度組(<5.0×105U/mL)和高濃度組(≥5.0×105U/mL)與健康對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 不同HCV-RNA濃度組之間凝血功能的差異±s)

3 討 論

由于HCV病毒基因的高度變異，不同基因分型HCV病毒表現出了不同的生物學特性，包括病毒的復制能力和致病能力，在本研究66例慢性HCV患者中，基因1型39例，非基因1型27例，基因1型和非1型患者血清中HCV-RNA濃度差異有統計學意義，不同基因分型HCV感染與血液中HCV的病毒濃度相關，基因1型患者HCV-RNA濃度高于非1型患者。本研究結果與其他學者的研究結果一致[3-6]。

PT主要反映外源性凝血系統狀況，PT延長主要見于凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ減少，FIB缺乏，維生素K缺乏，DIC等；APTT主要反映內源性凝血系統狀況，見于凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ減低，纖維蛋白原缺乏，抗凝物質存在等；TT主要反映纖維蛋白原(即凝血因子Ⅰ)轉為纖維蛋白的時間，TT延長見于低纖維蛋白原血癥、異常纖維蛋白原血癥。FIB主要反映纖維蛋白原的濃度，FIB減少見于肝損傷，低纖維蛋白原血癥，異常纖維蛋白原血癥等。

HCV基因分型不但與聚乙二醇干擾素的抗病毒療效相關，而且與肝臟組織的病理損傷相關，如1b型多見于失代償期肝硬化和原發性肝癌的患者，1a、2a、2b、3a型則多見于慢性HCV不合并肝硬化和肝癌患者，基因3a型與肝臟脂肪病變的關系比較密切[11]。劉志英等[12]對92例北京地區肝硬化和慢性HCV患者進行的基因型分布比較結果表明，尚未發現HCV基因型因肝病嚴重程度而有所不同。本研究顯示，基因1型和非1型患者之間的凝血功能4項指標的差異無統計學意義，但HCV基因型是否與肝臟的組織損傷相關需要進行肝組織病理學檢查進一步明確。

雖然HCV特異性的細胞免疫可造成肝細胞的損傷，但更主要的是干擾細胞的代謝，同時，病毒蛋白直接刺激成纖維細胞產生纖維組織，從而造成在多數慢性HCV肝炎患者的PT、APTT、TT和FIB常在相對低水平波動[13-16]。說明凝血功能指標變化雖可反映肝細胞損害程度，但該指標與HCV感染引起的肝組織炎性反應程度和病情的嚴重程度不一定平行。其他學者的研究也顯示，HCV感染者中肝組織的損傷和HCV-RNA的病毒濃度無關，不能以病毒濃度來判斷肝組織的炎性反應活動程度[17-19]。

綜上所述，慢性HCV患者不同基因分型HCV感染與HCV的病毒濃度相關，基因1型患者HCV-RNA濃度高于非1型患者。HCV基因分型和RNA病毒濃度與凝血功能各項指標大小無關，但是慢性HCV患者較健康人群，凝血功能降低。因此，對于HCV感染者有必要進行凝血功能檢查，以便了解慢性HCV患者凝血功能狀態，防止出現嚴重的出血。

[1]Pol S,Corouge M.Treatment of hepatitis C:current status and perspectives[J].Rev Prat,2014,64(5):605-612.

[2]Alexopoulou A,Papatheodoridis GV.Current progress in the treatment of chronic hepatitis C[J].World J Gastroenterol,2012,18(42):6060-6069.

[3]嚴艷,李卓,郭向華,等．北京地區慢性丙型肝炎患者血清HCV-RNA定量檢測與基因分型的研究[J]．醫學理論與實踐,2007,20(7):756-757．

[4]Yoo TW,Donfield S,Lail A,et al.Effect of hepatitis C virus(HCV) genotype on HCV and HIV-1 disease[J].J Infect Dis,2005,191(1):4-10.

[5]Marrone A,Sallie R.Genetic heterogeneity of hepatitis C virus:the clinical significance of genotypes and quasispecies behavior[J].Clin Lab Med,1996,16(2):429-449.

[6]Bukh J,Miller RH,Purcell RH.Genetic heterogeneity of hepatitis C virus:quasispecies and genotypes[J].Semin Liver Dis,1995,15(1):41-63.

[7]Rehermann B.Hepatitis C virus versus innate and adaptive immune responses:a tale of coevolution and coexistence[J].J Clin Invest,2009,119(7):1745-1754.

[8] Zeisel MB,Fafi-Kremer S,Robinet E,et al.Adaptive immunity to the hepatitis C virus[J].Viruses,2009,1(2):276-297.

[9]Heim MH.Innate immunity and HCV[J].J Hepatol,2013,58(3):564-574.

[10]高得勇,張欣欣.丙型肝炎免疫發病機制的研究進展[J].國際流行病學傳染病學雜志,2006,33(1):61-64.

[11]解瑩,謝晨.丙型肝炎病毒基因分型的研究進展[J].大連醫科大學學報,2010,32(4):470-474．

[12]劉志英,魏紅山,戴旺蘇,等.北京地區丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒基因分型[J].中華流行病學雜志,2005,2(26):148-149．

[13]Felmlee DJ,Hafirassou ML,Lefevre M,et al.Hepatitis C virus,cholesterol and lipoproteins--impact for the viral life cycle and pathogenesis of liver disease[J].Viruses,2013,5(5):1292-1324.

[14]Koike K,Tsutsumi T,Yotsuyanagi H,et al.Lipid metabolism and liver disease in hepatitis C viral infection[J].Oncology,2010,78(1):24-30.

[15]Koike K.Steatosis,liver injury,and hepatocarcinogenesis in hepatitis C viral infection[J].J Gastroenterol,2009,44(19):82-88.

[16]Domitrovich AM,Felmlee DJ,Siddiqui A.Hepatitis C virus nonstructural proteins inhibit apolipoprotein B100 secretion[J].J Biol Chem,2005,280(48):39802-39808.

[17]李蘊銣,凌偉,陳鳳新,等.慢性丙型肝炎患者脂類代謝與丙型肝炎病毒復制以及肝臟病理的關系[J].世界華人消化雜志,2010,18(17):1820-1823.

[18]王敏樂,曉華,韓紅星,等.HCV-RNA病毒載量和肝臟病理的關系[J].實用醫學雜志,2006,22(13):1513-1514.

[19]Rodríguez-Iigo E,López-Alcorocho JM,Bartolomé J.Percentage of hepatitis C virus-infected hepatocytes is a better predictor of response than serum viremia levels[J].J Mol Diagn,2005,7(4):535-543.

Relationship between HCV genotypes with content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients*

JIANGShu-peng,LIYan△,WANGMing,QIAOBin

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Hubei430060,China)

Objective To investigate the relationship between HCV genotypes with content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients.Methods 66 patients with chronic hepatitis C and 20 healthy control subjects in our hospital were enrolled in this study.The HCV genotypes were determined by ABI3500dx gene sequencing machine and the level of serum HCV-RNA was measured with Roche Light Cycler real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction system.The level of PT,APTT,TT,FIB detection in all cases was examined.Results In 66 cases of chronic hepatitis c patients,six virus genotypes were detected which were,1a,1b,2a,3a,3b and 6a,respectively.The genotype 1 was 39 cases,and the other of non-genotype 1 was 27 cases.The comparative difference level of serum HCV in patients with different HCV genotypes was statistically significant (P<0.05).As to the coagulation function,no significant difference of the genotype 1 and the non-genotype 1 was found(P>0.05)，and the difference between the healthy control and HCV genotype group(the genotype 1 and the non-genotype 1) in the coagulation function was statistically significant(P<0.05).The level of PT,APTT,TT,FIB were not related with HCV-RNA content with coefficient correlation 0.020,0.002,-0.072,-0.088,respectively(P>0.05).The different of coagulation function between the low HCV-RNA content group(<5.0×105U/mL) and high content group(≥5.0×105U/mL) had no statistical significance(P>0.05)，and the difference of coagulation function between HCV-RNA content group(The low HCV-RNA content group and high content group) and healthy control group was statistically significant(P<0.05).Conclusion The HCV genotype is associated with HCV-RNA content in the serum,and HCV-RNA content with HCV genotype 1 patients is higher than those with non-genotype 1 patients.The relationship between HCV genotypes,the content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients is not apparent,but compared with healthy people,coagulation function of the patients with chronic hepatitis C decreases.The test of coagulation function is necessary for HCV infection in order to know the state of blood coagulation function in patients with chronic hepatitis C,and prevent severe bleeding.

chronic hepatitis C; HCV genotypes； HCV-RNA content; coagulation function

國家重點臨床專科建設項目[財社(2010)305號]。

姜樹朋，男，在讀碩士研究生，主要從事個體化醫療與分子診斷方面的研究。△

，E-mail：yanlitf1120@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.001

A

1672-9455(2015)08-1027-03

2014-11-15

2014-12-22)