外源性一氧化碳釋放分子2對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用研究*

劉志剛，熊 敏，余化龍，曾 云(湖北醫藥學院附屬東風醫院骨科研究所，湖北十堰 442000)

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外源性一氧化碳釋放分子2對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用研究*

劉志剛，熊 敏△，余化龍，曾 云(湖北醫藥學院附屬東風醫院骨科研究所，湖北十堰 442000)

目的 探討外源性一氧化碳釋放分子2(CORM2)對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用與相關機制。方法 將30只健康雄性Wistar大鼠分為實驗組、對照組、空白組，每組各10只。實驗組在造模前1 h尾靜脈注射外源性CORM2。實驗組和對照組采用相同的方法造模。對照組造模后1 h注射與實驗組相同劑量的生理鹽水。空白組僅完成開腹和關腹操作，并術后1 h注射與實驗組相同劑量的生理鹽水。在術后不同時間進行神經行為學評分(Tarlov評分)、脊髓組織病理學檢查和白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測。結果 再灌注后不同時間點，實驗組Tarlov評分均高于對照組，但實驗組和對照組Tarlov評分均低于空白組(P<0.05)。缺血再灌注48 h后，對照組脊髓組織標本可見損傷及壞死神經元，表現為細胞核固縮或溶解，細胞質中的尼氏體消失；空白組脊髓組織標本中可見正常神經元，表現為結構呈多角形，細胞質中可見尼氏體；實驗組脊髓組織標本中的神經元壞死表現介于對照組和空白組之間。缺血再灌注48 h，實驗組與對照組IL-6、TNF-α表達水平均高于空白組，但實驗組IL-6、TNF-α表達水平低于對照組(P<0.05)。結論 外源性CORM2可抑制炎性因子的表達，對大鼠脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

外源性一氧化碳釋放分子2； 脊髓缺血再灌注損傷； 白細胞介素-6； 腫瘤壞死因子-α

脊髓缺血是比較危重的疾病，可導致組織失活，乃至死亡[1]。在脊髓缺血的病理生理學發病過程中，對組織造成損傷的主要因素是血液再次灌注后，大量釋放的自由基所造成的嚴重細胞損傷[2]。由于脊髓的神經元細胞對缺血缺氧極為敏感，因此脊髓缺血再灌注損傷極易導致脊髓功能障礙和不可逆性脊髓神經元遲發性死亡[3-4]。一氧化碳(CO)是一種生物信號分子，其活性受到血紅素氧合酶(HO)的影響。HO是內源性CO的誘導酶，分為誘導型(HO-1)和結構型(HO-2)[5]。在脊髓組織缺血再灌注損傷過程中，HO-1表達水平明顯升高，阻斷HO-1則顯著加重組織損傷，間接證實CO對于組織缺血再灌注損傷具有保護作用[6-7]。CO可以促使血管平滑肌舒張，降低細胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達水平，進而抑制炎性細胞和血小板的聚集和黏附[8]。此外，CO可通過抑制核因子κB(NF-κB)信號途徑實現保護效應，抑制炎性介質局部聚集[9]。本研究探討了外源性一氧化碳釋放分子2(CORM2)對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用與相關機制。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠30只，體質量220～260 g，由本院實驗動物中心提供。

1.2 儀器與試劑 TB209312型臺式冷凍高速離心機購自美國Beckman公司，AB873011型組織機械勻漿機購自上海瑞賽斯儀器有限公司。炎性因子白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒購自北京華英生物技術研究所，絲裂原活化蛋白激酶P38(MAPK P38)抗體購自碧云天生物技術研究所。經去RNA酶處理的二乙基焦磷酰胺(DEPC)及Trizol試劑購自北京賽百盛生物公司。轉錄試劑盒、核酸酶抑制劑及Taq酶購自日本寶生物工程有限公司。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。用于動脈結扎的0、4、10號愛惜康牌外科縫線購自美國強生公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將30只Wistar大鼠分為實驗組、對照組、空白組，每組各10只。造模前1 h，實驗組按照8 mg/kg的劑量尾靜脈注射濃度為40 mmol/L的外源性CORM2。對照組及空白組在造模前不進行任何預處理。

1.3.2 動物模型制作 實驗組及對照組大鼠經10%水合氯醛麻醉后，仰臥固定。于左側助骨下緣助中線切口，切口長度5 cm，依次切開皮膚、腹肌后入腹，找到左側腎后于腎門部位確定腎動脈，沿動脈游離至腹主動脈；分別使用10、4、0號外科縫線結扎動脈，結扎使用活結，留長線頭于體外；依次關腹、縫皮后留置線頭。于術后30 min、45 min和1 h抽線松節。實驗組大鼠造模后不給予任何處理。對照組大鼠術后1 h注射與實驗組相同劑量的生理鹽水。空白組大鼠麻醉后僅完成開腹及關腹操作，術后1 h注射與實驗組相同劑量的生理鹽水，不對脊髓及血管進行操作。

1.3.3 觀察指標 (1)神經行為學評分：實驗組與對照組大鼠在松結后，即再灌注后6、24、48 h，空白組大鼠在術后6、24、48 h，參照Tarlov標準進行神經行為學評分并記錄評分結果。0級(0分)：無可察覺的后肢活動；1級(1分)：有可察覺的微弱后肢活動，但無法對抗重力；2級(2分)：后肢能對抗重力，但無法站立；3級(3分)：可正常站立、行走，但不能正常跳躍；4級(4分)：后肢功能完全恢復，能正常跳躍。(2)組織病理學檢測：在完成神經行為學評分后處死大鼠，切除L2～L4椎板，暴露L3～L4節段硬膜囊，切斷周圍神經根；分離脊髓組織，10%甲醛固定48 h，分節段石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后采用光學顯微鏡及電子顯微鏡進行觀察，計數正常神經元數目，觀察神經元損傷情況。(3)炎性因子檢測：取部分分離的脊髓組織，研磨、離心處理，提取細胞成分，給予刺激后檢測IL-6、TNF-α表達水平。IL-6、TNF-α檢測嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 造模情況 在再灌注48 h后進行組織病理學檢測，結果顯示，對照組組織標本鏡下可見損傷及壞死神經元，表現為細胞核固縮或溶解，細胞質中的尼氏體消失；空白組組織標本鏡下可見正常神經元，表現為細胞呈多角形，細胞核結構清晰，細胞質中可見尼氏體；實驗組組織標本壞死神經元的表現介于對照組與空白組之間，鏡下可見部分神經元的細胞核固縮或溶解，但結構相對清晰，部分細胞的細胞質中可見尼氏體。見圖1、2。

圖1 各研究組大鼠脊髓組織HE染色結果(400×)

圖2 各研究組大鼠脊髓神經元細胞HE染色結果(5 000×)

2.2 神經行為評分 實驗組大鼠各時間點Tarlov評分均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗組和對照組大鼠各時間點Tarlov評分均低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠不同時間點Tarlov評分比較(分，

2.3 炎性因子表達水平 再灌注48 h后，實驗組與對照組IL-6、TNF-α表達水平均高于空白組，且實驗組IL-6、TNF-α表達水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠再灌注48 h后IL-6和TNF-α表達水平比較

3 討 論

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱外科手術常見的創傷之一，其損傷機制尚未完全明確[10]。普遍認為脊髓缺血再灌注損傷機制涉及炎性因子與趨化因子表達水平的變化，細胞內外離子水平的變化，脊髓局部脂質過氧化和自由基的產生等[11-12]。

本研究采用外源性CORM2作為CO供應源，具有以下優勢。(1)外源性CORM2在溶解于二甲基亞砜后，其羰基被取代并釋放CO，且CO釋放時間可以持續24 h以上[13-14]。采用外源性CORM2作為CO供應源可確保在較長時間內均有足量的CO供應。(2)粉末狀外源性CORM2制劑更易于實現量化控制，更加精確。(3)采用液體制劑靜脈注射的方式釋放CO，比CO吸入給藥具有更高的安全性和可操作性，臨床價值也更加顯著。此外，與CO吸入給藥相比，靜脈注射外源性CORM2可以實現長期小劑量給藥，不僅避免了使用呼吸機，方便了動物模型的構建，也不會損傷肝臟、腎臟，避免對研究結果造成影響[15]。

本研究以動物模型為基礎，分析了外源性CORM2釋放的CO在大鼠脊髓缺血再灌注損傷中的保護作用。CO可以通過環磷酸鳥苷(cGMP)途徑發揮調節作用。CO進入細胞后，與細胞內可溶性鳥苷酸環化酶的血紅素基團中的Fe結合，通過調節離子通道產生多種生物學效應。此外，CO可通過一氧化氮合成酶(NOS)-cGMP途徑發揮調節作用，同時降低誘導型NOS(iNOS)和HO-1表達水平，抑制iNOS和HO的破壞作用，間接保護神經細胞。本研究結果顯示，在不同再灌注時間點，實驗組大鼠Tarlov評分均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且實驗組和對照組大鼠在不同再灌注時間點的Tarlov評分均低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)；此外，組織病理學檢查結果顯示，在缺血再灌注48 h后，對照組大鼠脊髓神經元損傷及壞死較為明顯，空白組大鼠幾乎不發生神經元損傷，而實驗組大鼠神經元損傷表現介于對照組和空白組之間。

在缺血再灌注過程中，NOS-cGMP途徑發揮了重要的調節作用，包括抑制細胞內NF-κB的表達，降低ICAM-1等黏附因子的表達，減少炎性因子IL-6、TNF-α的釋放，以及促進過氧化物的清除，從而減低氧自由基水平等。外界刺激信號可作用于細胞內多種信號轉導通路，并最終將信號傳導至細胞核內，從而促進IL-6、TNF-α等炎性因子的產生和釋放[16]。抑制炎性因子的產生，可降低組織內多形核中性粒細胞的活化水平和聚集能力，避免組織結構和功能損傷，實現組織保護作用。本研究中IL-6和TNF-α檢測結果顯示，在缺血再灌注48 h后，實驗組與對照組IL-6、TNF-α水平均高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，但實驗組IL-6、TNF-α水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，說明外源性CORM2可抑制IL-6、TNF-α的表達。雖然在缺血及再灌注后應用外源性CORM2對組織具有一定的保護作用，但組織損傷已經產生，因此CO的保護作用有所減弱。

綜上所述，外源性CORM2可抑制炎性因子的表達，因此對大鼠脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

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Protective effects of exogenous carbon monoxide releasing molecules 2 in rat with spinal cord ischemia and reperfusion injury*

LIUZhi-gang,XIONGMin△,YUHua-long,ZENGYun

(InstituteofOrthopaedics,AffiliatedDongfengHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To investigate the protective effects of exogenous carbon monoxide releasing molecules 2 (CROM2) in rat with spinal cord ischemia and reperfusion injury.Methods A total of 30 healthy male Wistar rats were divided into experiment group,control group and blank group,with 10 rats in each group.Rats of experiment group were given exogenous CORM2 by intravenous injection 1 h before modeling.Same operation was performed in experiment group and control group to construct rat models.Rats in control group were injected the same dose of saline 1 h after the construction of models.Rat in blank group were given only abdominal operation without any other treatment,and were injected the same dose of saline 1 h after operation.At different time point of operation,evaluation of Tarlov scale,histopathology examination of myeloid tissue,and detection of interleukin-6(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were performed.Results At different time point of reperfusion,Tarlov scores of experiment group were higher than control group,but those of the two groups were lower than blank group (P<0.05).At 48 h after ischemia-reperfusion,damage of neuron in control group was obvious,which was not found in blank group,and the characteristics of neuron damage in experiment group were between control group and blank group.At 48 h after ischemia-reperfusion,levels of IL-6 and TNF-α in experiment group and control group were significantly higher than blank group,while those in experiment group were significantly lower than control group (P<0.05).Conclusion Exogenous CORM2 could be with protective effects of spinal cord ischemia-reperfusion injury,which might be dependent on the inhibition of the releasing of inflammatory cytokines.

exogenous carbon monoxide releasing molecules 2; spinal cord ischemia-reperfusion injury; interleukin-6; tumor necrosis factor-α

湖北省十堰市科技局基金支持項目[十科發(2013)20號]。

劉志剛，男，副主任醫師/講師，碩士，主要從事骨科疾病相關研究。△

，E-mail：xiongm4203@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.009

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1672-9455(2015)08-1048-03

2014-11-05

2014-12-10)