Slit2/Robo4信號通路在神經元遷移中的活力與凋亡影響

劉忠志,張正洪(湖北醫藥學院附屬東風醫院神經內科,湖北十堰 442000)

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Slit2/Robo4信號通路在神經元遷移中的活力與凋亡影響

劉忠志,張正洪(湖北醫藥學院附屬東風醫院神經內科,湖北十堰 442000)

目的 探討Slit2/Robo4信號通路在神經元遷移中的活力與凋亡影響，為闡明腦缺血后神經血管新生的機制提供理論和實驗依據。方法 選擇成年雄性遠交群(SD)大鼠，建立缺血性腦卒中動物模型，采用Western blot方法測定梗死側與非梗死側Slit2和Robo4的表達。取原代培養10～14 d的神經元種六孔板，分為加藥組H2O2(100 μmol/L)、對照組、H2O2(100 μmol/L)+Slit2 (3 μg/mL)組，行MTT方法檢測細胞活力與雙染流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果 Western blot結果顯示，梗死側Slit2和Robo4表達均較非梗死側明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。100 μmol/L H2O2處理原代培養神經元24 h會導致Slit2和Robo4表達升高(P<0.05)。MTT結果示，H2O2、H2O2+Slit2組細胞活力都有明顯下降，其中，H2O2+Slit2組的細胞存活率明顯高于單純H2O2組(P<0.05)。流式細胞學顯示，H2O2+Slit2組的細胞凋亡率明顯低于H2O2組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 缺血性腦卒中有內源性Slit2/Robo4信號通路的激活，而外源性Slit2可以促進氧化應激時神經元的存活能力，抑制其凋亡作用，從而起到神經保護作用。

Slit2/Robo4信號通路； 缺血性腦卒中； 神經元遷移

當前我國的缺血性腦卒中的發病率逐漸增高，病死率在20%左右，嚴重影響患者的身心健康[1]。眾所周知，當腦組織遭受到缺血、缺氧和外傷等有害刺激時，機體會啟動自身的固有機制，可達到減輕神經細胞損傷的目的[2-3]。其中機體引起的氧化應激會損傷細胞脂質膜、蛋白及DNA，導致細胞損傷。而腦組織中富含脂肪組織，對氧化應激更敏感，因而,氧化應激在腦缺血時更易引起神經組織的損傷[4]。在治療中，積極促進缺血性腦卒中神經元的存活能力，抑制神經元的凋亡，減少神經元損失，能有效改善預后[5-6]。近年來，隨著醫學分子生物學的發展，許多研究者正關注于研究抑制內源性缺血損傷反應和增強內源性神經保護作用的途徑，從而促進腦組織修復和再生[7]。20世紀末，Slit/Robo信號通路已經被明確闡述為細胞膜外蛋白，具有排斥、引導神經元軸突方向，控制神經元遷移等作用[8]。其中Slit2在腫瘤細胞的代謝中起著重要的作用，Slit2對于神經元的出芽和血管的再生作用可能與神經再生有關，Robo4作為一種Slit的血管專門受體[9]。Slit2分別通過與Robo4結合后抑制血管的再生，同時，通過抑制水腫的形成和組織損傷在缺血發生后發揮保護作用[10]。另外有研究表明，缺血性腦卒中后有內源性血管新生，新生的血管可更好地促進神經功能的恢復。為此，相關研究者逐漸開始致力于腦血管生成機制的研究，尋找治療缺血性腦卒中新的、更有效的治療策略[11-12]。本文具體探討了Slit2/Robo4信號通路在神經元遷移中的活力與凋亡影響，希望為闡明腦缺血后神經血管新生機制提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料 選擇成年雄性遠交群(SD)大鼠，為出生后1～3 d SD新生鼠(200～250 g)，清潔級，由本院動物中心提供，符合動物倫理學和動物實驗基本管理條例。

1.2 動物模型的建立 本文建立了缺血性腦卒中動物模型，其構建措施為：SD大鼠進行10%水合氯醛35 mL/kg麻醉、剪毛、消毒；選擇頸部正中切口，分離淺筋膜，暴露頸前肌群，可見頸總動脈，分離動脈鞘和迷走神經。結扎頸總動脈近心端，蛙心夾夾閉頸外動脈，打結頸總動脈近分叉處；選擇7號頭皮針扎頸外動脈分叉處，閉合創口。2 h后進行神經功能缺損評分，選擇評分結果為1～3分為成功模型進行實驗。

1.3 分組 SD大鼠行線栓法大腦動脈阻斷缺血模型3 d后殺死，取雙側大腦半球，以非梗死側為對照組，選擇Western blot方法檢測Slit2/Robo4信號途徑分子Slit2和Robo4變化。然后取原代培養10～14 d的神經元種六孔板，分為加藥組H2O2(100 μmol/L)及對照組，也采用Western blot方法檢測上述指標的變化。同時，取原代培養10～14 d的神經元種板，待24 h后細胞生長較為豐滿為加藥，分對照組、H2O2(100 μmol/L)組、H2O2(100 μmol/L)+Slit2(3 μg/mL)組，共3組，作用24 h后收集細胞行MTT方法檢測細胞活力，雙染流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

2 結 果

2.1 缺血性腦卒中的Slit2/Robo4信號通路變化對比 經過判定，動物模型都構建成功，同時，用抗神經元特異中間絲蛋白NESTIN抗體鑒定原代培養的神經元。結果顯示，90%以上實驗材料為NESTIN陽性細胞，即神經元含量占90%以上。筆者采用Western blot方法測定梗死側與非梗死側Slit2和Robo4的表達，結果顯示梗死側Slit2和Robo4表達均較非梗死側明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 動物模型中Shh信號傳導通路相關信號分子表達改變

2.2 神經元氧化應激Slit2/Robo4信號通路變化對比 筆者以100 μmol/L H2O2處理原代培養神經元24 h，Western blot方法觀察Slit2/Robo4信號通路分子表達改變，結果均有Slit2和Robo4表達升高(P<0.05)，表明神經元氧化應激損傷早期即有Slit2/Robo4信號通路的激活。見圖2。

2.3 細胞活力及凋亡的影響 原代培養10～14 d的神經元種六孔板，待24 h后細胞生長較為豐滿為加藥，分為對照組、H2O2(100 μmol/L)組、H2O2+Slit2組，作用24 h后收集細胞，觀察細胞凋亡及存活的改變。MTT結果示，H2O2、H2O2+Slit2組細胞活力都有明顯下降，其中H2O2+Slit2組的細胞存活率明顯高于單純H2O2組(P<0.05)，說明Slit2/Robo4信號通路可以促進氧化應激時神經元的存活。流式細胞學顯示，H2O2+Slit2組的細胞凋亡率明顯低于H2O2組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示Slit2/Robo4信號通路氧化應激時具有抗神經元凋亡作用。見圖3、4。

圖2 氧化應激Shh信號傳導通路相關信號分子表達改變

圖3 Hochest染色Shh對神經元氧化應激時神經元凋亡的影響(定量)

圖4 Hochest染色對神經元氧化應激時神經元凋亡的影響(定性)

3 討 論

當前，對于缺血性腦卒中的有效治療手段仍非常有限，在腦缺血時，防御和應激反應可觸發和啟動一系列內源性神經保護，其作用機制涉及腺苷、神經營養因子等多個環節。雖然目前內源性神經保護作用的存在和增強可顯著改善腦組織受損程度和預后已得到證實，但是具體機制還不明確[13]。

神經的連接構成了神經系統的發育基礎，在神經系統的發育過程中，軸突的生長受生長錐生長方向的分子調節和控制。一些軸突生長導向因子通過調節軸突生長時的吸引排斥信號影響軸突生長，這種信號調控也有助于血管的再生[14]。神經生長導向分子與生長抑制分子都由軸突延伸的四周和靶組織細胞產生，其可以與相應的特定受體分子作用，引導軸突靶向延伸，一些經典的神經生長導向因子在腦缺血時對神經元和血管均可起到促進新生進而改善神經功能恢復的作用[15]。而Slit是發現的第一種對神經生長和神經元遷移都有導向作用的因子，促進軸突向正確的方向延伸，同時，對神經元的遷移也有導向作用[16]。Slit可與其跨膜受體Roundabout(Robo)蛋白家族相結合，受體Robo主要表達于神經系統，Slit/Robo不僅參與生理病理情況下的突觸可塑性調節，而且還參與了各種腫瘤細胞的生長以及腫瘤血管生成的調節。研究已證明，在大鼠全腦缺血模型及神經元/神經膠質細胞模型中，Slit可以減少神經元和神經膠質細胞的死亡，并且Slit/Robo對神經元/神經膠質細胞具有直接的保護作用。

本文結果顯示，梗死側Slit2和Robo4表達均較非梗死側明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，提示在損傷早期即有Slit2和Robo4表達的明顯上調，提示Slit2/Robo4信號傳導通路可能為快速損傷反應因子，可能是一個對損傷反應的內源性保護機制。有研究也認為Slit2與Robo4相結合，能抑制血管內皮細胞的遷移，從而抑制血管的再生，表明Slit2激動Robo4后會抑制VEGF誘導內皮細胞的遷移、重組和構建[17]。

筆者以100 μmol/L H2O2處理原代培養神經元24 h，Western blot方法觀察Slit2/Robo4信號通路分子表達改變，結果均有Slit2/Robo4表達升高(P<0.05)，表明神經元氧化應激損傷早期即有Slit2/Robo4信號通路的激活，同時缺血及其他損傷可以促進神經再生[18]。

凋亡是一種細胞的程序性死亡，許多刺激因素可以通過激活凋亡傳導途徑及級聯放大反應等引起細胞凋亡。本文流式細胞學顯示，H2O2+Slit2組的細胞凋亡率明顯高于H2O2組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示Slit2/Robo4信號通路氧化應激時具有抗神經元凋亡作用。在神經發育的早期階段，Slit2/Robo4信號通路參與細胞凋亡的調節，對正常發育的維持起到重要作用[19]。而在缺血性腦卒中，細胞凋亡是缺血半暗帶區缺血再灌注損傷時細胞死亡的主要形式之一，缺血可誘發Slit2的表達，提示Slit2/Robo4信號通路在腦卒中通過抗凋亡途徑可能具有潛在的治療作用。

總之，缺血性腦卒中有內源性Slit2/Robo4信號通路的激活，而外源性Slit2可以促進氧化應激時神經元的存活能力，抑制其凋亡作用，從而起到神經保護作用，也提示Slit2/Robo4可能是缺血性腦卒中的一個重要的新的治療靶點。

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The viability and apoptosis effects of Slit2/Robo4 polarity signaling in neuronal migration

LIUZhong-zhi,ZHANGZheng-hong

(Departmentofinternalmedicine,AffiliatedDongfengHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To investigate the viability and apoptosis effects of Slit2/Robo4 polarity signaling in neuronal migration for providing theoretical and experimental mechanisms basis for elucidating cerebral ischemia angiogenesis.Methods Adult male SD rats were established animal models of ischemic stroke,the expression of non-infarct infarction side Slit2 and Robo4 were measured by the Western blot method.The neurons cell by 10-14 days primary cultured were selected and switched to six-well plat,there were divided dosing group H2O2(100 μmol/L),the control group and H2O2(100 μmol/L)+Slit2(3 μg/mL) group,the cell viability were detected by MTT and double staining apoptosis were detected by flow cytometry.Results Western blot showed infarction side Slit2 and Robo4 expression were significantly higher than that of non-infarcted side(P<0.05).When treated by the 100 μmol/L H2O2treatment of primary cultured neurons 24 hours will cause increased expression of Slit2 and Robo4(P<0.05).MTT results shown the H2O2,H2O2+Slit2 groups had significantly decreased in cell viability,which the cell survival rate of H2O2+Slit2 group were significantly higher than those of H202group(P<0.05).The apoptosis rate of H2O2+Slit2 group were significantly lower than those of Slit2 H2O2group(P<0.05).Conclusion Ischemic stroke had Slit2/Robo4 endogenous pathway activated,and the exogenous Slit2 can promote the viability of the neuronal oxidative stress and inhibit apoptosis,thereby it can protect the neuro.

Slit2/Robo4 signaling pathway; ischemic stroke; neuronal migration

劉忠志，男，主治醫師，本科，主要從事神經內科臨床工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.015

A

1672-9455(2015)08-1065-03

2014-11-10

2014-11-22)