乙型肝炎病毒DNA在低溫儲存血漿中穩定性的研究

謝 麗，鄧 燕，易 珍，陳學杰，黃 莉，李 山，秦 雪(廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，南寧 530021)

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乙型肝炎病毒DNA在低溫儲存血漿中穩定性的研究

謝 麗，鄧 燕，易 珍，陳學杰，黃 莉，李 山△，秦 雪(廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，南寧 530021)

目的 了解-20 ℃條件下儲存30 d后血漿中乙型肝炎病毒(HBV)脫氧核糖核酸(DNA)的穩定性。方法 收集載量103～107copy/mL的30份乙型肝炎患者血漿，并分為低載量組、中載量組、高載量組。標本采集后立即分離血漿并進行基線(0 d)載量檢測，其余血漿于-20 ℃存儲，分別在第1、3、7、14、21和30天進行實時熒光定量測定。結果 (1)將30份樣本進行不同時間點的配對t檢驗，載量差異均無統計學意義：第1天與第0天比較(t=-0.327，P=0.746)；第3天與第0天比較(t=-0.718，P=0.479)；第7天與第0天比較(t=-0.682，P=0.500)；第14天與第0天比較(t=-1.072，P=0.292)；第21天與第0天比較(t=-0.818，P=0.420)；第30天與第0天比較(t=0.635，P=0.530)。(2)分組比較中，第30天與第0天比較，HBV DNA載量差異無統計學意義：低載量組P=0.984；中載量組P=0.708；高載量組P=0.120。結論 -20 ℃儲存30 d，血漿標本HBV DNA載量未出現連續下降或上升趨勢，且不同時間點與第0天的基線載量比較差異無統計學意義。

儲存時間； 乙型肝炎病毒； DNA； 穩定性

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個全球性的健康問題，是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一。我國是HBV感染的高發地區，慢性乙型肝炎患者的高病毒載量與肝細胞性肝癌的發展密切相關[1]。目前，HBV感染的實驗室診斷主要依賴血清特異性抗原抗體和DNA的檢測，包括時間分辨熒光分析法、酶免疫測定技術、放射免疫分析法和實時熒光定量檢測(RT-PCR)。前三種方法用于檢測HBV血清標志物，是根據人體對HBV的免疫反應產生的表達產物及其抗體應答系統進行檢測，間接反映復制情況。而RT-PCR是檢測HBV的核酸，能更精確反映人體內HBV的數量狀態，直接反映HBV復制傳染性的指標。RT-PCR方法可用于診斷感染的慢性攜帶者、抗病毒治療后的療效評估、治療藥物的選擇及協助診斷因遺傳變異導致的血清學無法檢測者[2-3]。本研究將30份血漿標本在-20 ℃條件下儲存30 d，在第1、3、7、14、21和30天的6個時間點進行動態檢測，分析穩定性，希望為相關實驗室提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本取自2013年1～8月廣西醫科大學第一附屬醫院感染性疾病科收治的乙型肝炎患者血漿30份，其中男22份，女8份；年齡16～45歲，平均28歲。其中，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗體(抗-HBe)、乙型肝炎病毒核心抗體(抗-HBc)3項陽性即“小三陽”者18例，HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、抗-HBc 3項陽性即“大三陽”者12例。

1.2 血漿樣本 根據載量將30份無溶血的血漿樣本分成3組：(1)10份樣本為低載量(103～104copy/mL)，平均4 906 copy/mL，范圍在1 754～8 153 copy/mL；(2)10份樣本為中載量(104～105copy/mL)，平均52 647 copy/mL，范圍14 780～88 912 copy/mL；(3)10份樣本為高載量(105～107copy/mL)，平均1 002 528 copy/mL，范圍85 670～2 511 660 copy/mL。

1.3 RT-PCR檢測

1.3.1 樣本處理 每例患者收集10 mL的全血至含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管(上?？迫A診斷醫療產品有限公司)，然后立即運送至實驗室進行離心分離(700 r/min離心10 min)。取離心后無溶血的血漿標本1 mL立即進行基線RT-PCR分析(0 d)，其余血漿分成6管，每管1.5 mL在-20 ℃存儲，分別在第1、3、7、14、21和30天取其中一份標本進行RT-PCR。每次檢測前均進行再次離心(700 r/min離心10 min)。

1.3.2 RT-PCR 核酸提取和RT-PCR均使用乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量測定試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)。在PCR反應管中加入5 μL核酸釋放劑(試劑盒提供)，再加入5 μL待測血漿樣本，混勻后室溫靜置10 min，加入40 μL PCR反應試劑，混勻后上機進行PCR擴增。擴增和循環條件為：55 ℃反應2 min，94 ℃反應5 min，再按94 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s進行45個循環。每次運行包含陰性對照、陽性對照和空白對照，陽性定量參考品(試劑盒提供)，同血清樣本一起上機擴增，判斷是否存在PCR抑制和防止假陽性結果。反應結束后，儀器根據標準曲線自動給出結果。實驗室室溫保持在22～24 ℃，相對濕度(65±5)% 。所有標本都是由相同的技術人員在同等條件下完成。

1.4 統計學處理 數據首先進行log10轉換，應用配對t檢驗進行統計學分析，P<0.05表示差異有統計學意義，所有數據均經SPSS 17.0統計軟件包處理。

2 結 果

2.1 不同時間點RT-PCR檢測的載量 在30份血漿標本檢測過程中，所有對照都成功地被檢測，表明RT-PCR過程中無抑制和假陽性現象。各組標本在第0、1、3、7、14、21和30天RT-PCR檢測的平均載量值如表1所示。

表1 不同時間點RT-PCR檢測的HBV載量(log10 copy/mL)

HBV低載量組10份標本中，每毫升標本拷貝數的常用對數值3.192～3.911，在7個不同時間點檢測的平均病毒載量相近，第0天與第30天平均病毒載量的常用對數值為3.638和3.639，且差異無統計學意義(t=0.021，P=0.948)。中載量組10份標本中，每毫升標本拷貝數的常用對數值4.170～4.949，在不同時間點檢測的平均病毒載量相近，第0天與第30天平均病毒載量的常用對數值由4.658下降至4.648，且差異無統計學意義(t=-0.387，P=0.708)。高載量組10份標本中，每毫升標本拷貝數的常用對數值4.933～6.400，第0天與第30天平均病毒載量的常用對數值由5.747升高至5.780，且差異無統計學意義(t=1.717，P=0.120)。將30份樣本進行不同時間點的配對t檢驗，載量差異無統計學意義，第1天與第0天比較(t=-0.327，P=0.746)；第3天與第0天比較(t=-0.718，P=0.479)；第7天與第0天比較(t=-0.682，P=0.500)；第14天與第0天比較(t=-1.072，P=0.292)；第21天與第0天比較(t=-0.818，P=0.420)；第30天與第0天比較(t=0.635，P=0.530)。

圖1 第30天和第0天血漿樣本穩定性比較

2.2 RT-PCR檢測的第30天與第0天HBV載量值比較 所有30份標本RT-PCR檢測的第30天與第0天HBV載量值見圖1。其中，有4份標本第30天HBV載量值與第0天相近或重疊(7號、9號、24號和30號標本)；12份標本為第30天HBV載量值較第0天低(0.044±0.030)，差異有統計學意義(t=5.085，P=0.000)；14份標本為第30天HBV載量值比第0天稍高(-0.052±0.049)，差異有統計學意義(t=-4.031，P=0.001)。全部樣本第30天與第0天比較，HBV載量差異無統計學意義(t=0.635，P=0.530)。

3 討 論

到目前為止，RT-PCR是一種快速、敏感、實用的檢測方法。但是，在我國仍有許多醫院并未具備開展檢測病毒載量的臨床基因擴增實驗室。因此，部分乙型肝炎患者標本只能定時定點地送往遠離的病毒學實驗室?？梢姡攧罩笔侨绾伪ＷC血液標本收集、處理和存儲方法正確、恰當并優化，以確保后續HBV載量檢測結果的準確性和重復性。

PCR技術中核酸提取是一個重要環節，本試驗中采用一步法提取，無需對樣本進行加熱、高速離心富集病毒等過程，能夠避免病毒核酸的損失，也避免了可能的核酸酶污染，從而使定量更準確。Schafer等[4]認為，延遲血漿樣本的處理可能導致巨細胞病毒PCR結果的假陽性率增高。自從HBV檢測試劑盒商品化后，分析前質量控制的重要性就不言而喻，如樣本收集、運輸、處理等，延遲處理就可能導致細胞破壞、標本溶血，影響PCR檢測的準確性[4]。為排除血漿中不可預測的影響因素，本研究在每次測試前都對樣本進行重復離心，從而有助于確保PCR檢測的準確性，對于第30天載量測定與第0天之間差異無統計學意義起一定的積極作用。

對于血清樣本的穩定性，不僅儲存溫度、儲存時間對其有影響，反復凍融也可能是影響因素之一。Sanlidag等[5]對5份血清樣本在首次采集后于-20 ℃凍存2 d，在隨后的10次反復溶解、凍存中檢測穩定性，結果未見改變。表明對于臨床標本無需采集后進行小份分裝，不但減少工作強度，且在反復凍存、溶解10次內進行檢測，其結果仍然有效。但是，該試驗標本較少，其可靠性仍需進一步證實。而本試驗中，每份標本的檢測均為一次性凍存和溶解過程，排除了多次反復凍存溶解對結果的可能影響。結果顯示，不管是分為HBV低病毒載量組、中病毒載量組和高病毒載量組，或不分組分析，30份樣本的HBV平均載量值在第0天與其他6個時間點(第1、3、7、14、21、30天)比較，差異無統計學意義，試驗中血漿樣本儲存于-20 ℃，結果與已發表的研究相似。Jose等[6]報道，血漿樣本在5、25 ℃儲存28 d，其穩定性不變。Gessoni等[7]研究報道，血漿樣本丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV-1) 和HBV的穩定性，在4 ℃條件下，HCV和HIV-1的核糖核酸能夠儲存72 h，HBV DNA能夠儲存7 d。

對于定量PCR檢測的室間質量評價的可接受范圍，我國衛生部臨床檢驗中心采用溯源至國家標準品得出的檢測值換算成的對數值±0.4為可接受范圍[8]。試驗的30份標本，可能由于個體差異和技術固有誤差而導致第30天結果低于或高于第0天，分別比較后差異有統計學意義，但各對數值均在可接受范圍內。當不分組比較后，全部樣本第30天與第0天比較HBV載量差異無統計學意義(t=0.635，P=0.530)，說明升高或降低對臨床判斷影響極小。同樣，Baleriola等[9]報道，臨床樣品在-20、-70 ℃存儲長達9年后，檢測HCV、HIV、HBV載量，認為其改變對于臨床判斷無影響。并且，Fung等[10]報道，冷凍保存105份臨床樣品12個月后，其HBsAg表達也無改變，仍可用于臨床監測。

綜上所述，本研究結果表明，血漿標本-20 ℃儲存30 d中，在第1、3、7、14、21和30天的6個時間點進行動態檢測，HBV載量未出現連續下降或上升的改變，且不同時間點與第0天的基線載量比較差異均無統計學意義。希望能為相關臨床實驗室提供有用的試驗依據：如果未能每天進行PCR檢測，可在一定時間內(30 d)每周進行幾次HBV載量的批處理測試；對于一些臨床需要復檢的結果，在排除不可預測的血漿因素后(如重復離心)，30 d內進行重復檢測，其結果可信；實驗室都應根據各自的技術條件對臨床標本的儲存條件進行優化，以保障PCR檢測的規范性和結果的準確性。

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Stability of hepatitis B virus DNA in plasma in low temperature storage

XIELi,DENGYan,YIZhen,CHENXue-jie,HUANGLi,LIShan△,QINXue

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion530021,China)

Objective To analyze stability of HBV DNA in 30 EDTA anticoagulants plasma in the order of magnitude between 1 000 and 10 000 000 copy/mL over a 30 day period.Methods Thirty plasma samples were grouped into three categories according to the viral loads,including low viral loads,intermediate viral loads and high viral loads.Ten milliliters of whole blood was freshly collected from each patient.Plasma samples without hemolysis were divided into 1 mL aliquots.One aliquot was processed immediately(Day 0) for baseline RT-PCR assays.The remaining aliquots were then processed after 1,3,7,14,21 or 30 day of storage at -20 ℃.Results There was no significant difference between the mean of the difference time point in viral loads following storage at -20 ℃ by paired-samples t test,including Day 1 compared to Day 0 (t=-0.327，P=0.746),Day 3 compared to Day 0(t=-0.718，P=0.479),Day 7 compared to Day 0(t=-0.682，P=0.500),Day 14 compared to Day 0 (t=-1.072，P=0.292),and Day 21 compared to Day 0 (t=-0.818，P=0.420).Day 30 compared to Day 0(t=0.635，P=0.530).Conclusion The concentration of HBV DNA in all samples stored at -20 ℃ for 30 days did not differ significantly from the baseline viral load,and it was not observed the trend in continued degradation in different time point( Day 1,3,7,14 and 21).

prolong period; cytomegalovirus; DNA; stability

謝麗，女，主管技師，在讀博士，主要從事基因組學方面的研究。

△通訊作者，E-mail：lis8858@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.023

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1672-9455(2015)08-1086-03

2014-12-05

2014-12-20)