腦膠質瘤患者圍手術期外周血樹突狀細胞亞群變化及意義*

謝明祥，王 偉，劉后銀(．遵義醫學院附屬醫院神經外科，貴州遵義 5600；．四川省眉山市仁壽縣人民醫院神經外科 60500；．蚌埠醫學院第一附屬醫院神經外科，安徽蚌埠 000)

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腦膠質瘤患者圍手術期外周血樹突狀細胞亞群變化及意義*

謝明祥1，王 偉2，劉后銀3(1．遵義醫學院附屬醫院神經外科，貴州遵義 563003；2．四川省眉山市仁壽縣人民醫院神經外科 620500；3．蚌埠醫學院第一附屬醫院神經外科，安徽蚌埠 233000)

目的 應用流式細胞分析技術對腦膠質瘤患者圍手術期外周血樹突狀細胞(DC)亞群變化進行分析，探討其數量、變化規律及不同惡性程度膠質瘤患者免疫功能的差異。方法 檢測試驗組及對照組DC1、DC2，抽取外周血，應用流式細胞儀檢測外周血DC1、DC2。結果 外周血流式細胞儀結果分析，兩組DC1/PBMC(外周血單個核細胞)、DC2/PBMC比較，差異有統計學意義(P<0.05)。膠質瘤患者術后早期外周血DC1/PBMC、DC2/PBMC百分比與術前比較有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)。腦膠質瘤患者術后晚期外周血DC1/PBMC的百分比高于術后早期，差異有統計學意義(P<0.05)。惡性程度高的膠質瘤患者圍手術期DC1/PBMC、DC2/PBMC低于惡性程度低的膠質瘤患者。結論 腦膠質瘤患者與健康人比較，外周血中DC1/PBMC、DC2/PBMC比例下降，表明腦膠質瘤患者較健康人免疫功能降低；膠質瘤患者外周血DC亞群數量與膠質瘤惡性程度呈負相關。

腦膠質瘤； 外周血； 樹突狀細胞亞群； 圍手術期

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，雖然免疫治療取得一定進展，但療效不確切。樹突狀細胞(DC)是體內重要的抗原遞呈細胞，能對腫瘤加以識別及對抗，在外周血中含量為白細胞總數的1%。膠質瘤能分泌多種免疫抑制因子和免疫逃逸因子，使宿主的免疫系統對腫瘤抗原無法加以識別，有研究發現，DC能夠高表達MHC-Ⅰ和MCH-Ⅱ類分子、共刺激分子和黏附分子，從而克服腫瘤細胞免疫原性弱及共刺激分子和黏附分子表達的缺陷。外科手術可以最大限度地減少膠質瘤的體積，降低膠質瘤分泌的多種免疫抑制因子和免疫逃逸因子的量，改善膠質瘤患者免疫功能。本課題應用流式細胞分析技術，研究膠質瘤患者圍手術期外周血DC亞群變化與手術治療及惡性程度的關系，為腦膠質瘤免疫治療提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 試驗耗材包括：一般固定液、棉簽、紗布、醫用消毒液、醫用石蠟、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管、75%醫用乙醇等。實驗試劑包括：CD123-PE、CD11C-PE、anti-HLA-DR-PECy5(美國BD公司)；洗液：磷酸鹽緩沖液pH7.43；固定液：1%多聚甲醛(實驗室自配)；堿性粒細胞、白細胞溶解液STROMATOLYSER-FB、白細胞溶解液STROMATOLYSER-4DL、白細胞染液 STROMATOLYSER-4DS、清洗液CELLCLEAN(日本Sysmex公司)。主要試劑配制：PBS緩沖液、1%多聚甲醛。主要實驗儀器及設備：BD-FACB Calibu流式細胞分析儀、振蕩混勻器、離心機、石蠟切片機、普通顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 分組 試驗組患者15例：住院行腫瘤切除術，術后病理學檢查確定為腦膠質瘤患者，術前(1 d)及術后(1、3、5、7 d)外周血DC1、DC2細胞百分比。對照組：無相關腫瘤、無免疫性疾病史及無各種過敏史的健康人群組15例，同法進行相關檢測。

1.2.2 排除標準 有免疫系統疾病或感染性疾病；60 d內接受放、化療或使用影響免疫功能的藥物；合并腫瘤并發癥(腫瘤卒中、腦疝等)，手術中輸血均不納入研究對象。所有入組患者均知情同意。

1.2.3 外周血流式細胞術檢查 試驗組與對照組血樣均采用EDTA抗凝管采集2 mL并暫時保存于4 ℃冰箱，采集后的新鮮血樣于24 h之內送至本院細胞工程實驗室，采用流式細胞儀檢測血液中的DC1、DC2，并收集原始數據。

1.2.4 腫瘤患者手術切除腫瘤組織的病理檢查 手術中切除的新鮮腫瘤組織經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，每個蠟塊按照20～40 μm的間隔連續切片，切片厚度4 μm；然后從不同代表平面的10張切片中選取2張進行常規病理HE染色，由病理科協助完成。

1.3 統計學處理 所得數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，統計方法采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 健康人群及腦膠質瘤患者組外周血DC1和DC2檢測結果 見表1、圖1。

表1 健康人群及腦膠質瘤患者組外周血DC1和DC2的檢測結果

圖1 健康人群與腦膠質瘤患者術前、術后早期、術后晚期DC1/PBMC、DC2/PBMC比較

2.2 不同惡性程度腦膠質瘤患者圍手術期外周血DC1和DC2檢測結果 見表2、圖2。

表2 不同惡性程度腦膠質瘤患者圍手術期外周血DC1和DC2檢測結果

圖2 不同惡性程度的腦膠質瘤患者圍手術期6次外周血流式細胞儀檢測DC1/PBMC、DC2/PBMC比較(%)

3 討 論

研究表明，腦腫瘤患者的免疫功能與其他腫瘤患者一樣，有所降低。在手術切除腫瘤后，降低的免疫功能則逐漸恢復，而當腫瘤復發時，患者的免疫水平又可再次降低。因此，了解腦腫瘤患者的免疫功能狀態，對其病情判斷和預后有重要意義。而外周血DC的數值和性狀常反映出生理和病理狀況下DC在免疫應答中的地位，進而反饋出機體的免疫狀況[1]。

結果顯示，(1)腦膠質瘤患者術前外周血DC1、DC2占單個核細胞的百分含量均明顯低于健康者，差異有統計學意義(P<0.05)。DC1、DC2百分含量的下降表明腦膠質瘤患者機體的抗原遞呈細胞減少，激活T淋巴細胞的能力降低，提示腦膠質瘤存在保護性免疫反應減弱，機體免疫功能降低。(2)腦膠質瘤患者術后1～3 d外周血DC1、DC2占單個核細胞的百分比明顯低于術前及健康者，差異有統計學意義(P<0.05)，表明腦膠質瘤患者免疫功能的降低一方面可能是手術出血，另一方面手術創傷對機體細胞免疫功能也有顯著的抑制作用，尤其是腦膠質瘤手術創傷較大，可使兒茶酚胺、糖皮質激素等多種內源性激素釋放入循環血液中，損害T細胞的增殖；并可導致前列腺素、血清抑制活性多肽等的產生和釋放，從而抑制患者的免疫功能。(3)腦膠質瘤患者術后5～7 d外周血DC1占單個核細胞的百分比高于術后1～3 d，差異有統計學意義(P<0.05)。表明膠質瘤患者在手術后一定時間段后機體的免疫功能抑制減少，患者腫瘤組織減少，腫瘤分泌的免疫逃避因子減少，免疫狀態好轉，而已知的研究結果表明術后的各種抑制作用在術后可持續4～10 d，然后才逐漸恢復[2-4]。作者認為，一方面是腦腫瘤切除術后時間較短，盡管機體的細胞免疫功能有所恢復，但仍未達到正常水平；另外，由于手術創傷使患者細胞免疫反應抑制等所致，這種抑制可長達3周，但這種抑制并非是細胞分化和發育異常，可能與淋巴細胞的異常分布有關。由于手術對機體組織的損傷及麻醉等均會造成嚴重干擾，可能在目前尚未明確的某種機制調節下，外周血淋巴細胞中的輔助T細胞較多地進入淋巴結、扁桃體、脾臟等組織，而抑制性T細胞則較多地從上述組織中釋出，造成外周血輔助T細胞與抑制T細胞比值的相應改變[5]。(4)腦膠質瘤患者術后1～3 d及術后5～7 d患者外周血DC1/PBMC、DC2/PBMC均低于術前及健康者，差異有統計學意義(P<0.05)，表明雖然膠質瘤患者在手術后一定時間段機體的免疫功能抑制減少，免疫狀態好轉，但可能由于腦手術創傷及膠質瘤無法完全切除，導致腫瘤細胞繼續分泌免疫抑制因子等，致使患者免疫狀態仍然低于術前。(5)不同惡性程度的腦膠質瘤患者在圍手術期行DC1及DC2檢測分析提示，低級別膠質瘤患者DC1/PBMC、DC2/PBMC分別高于高級別膠質瘤患者，原因可能是高級別膠質瘤患者瘤體生長更旺盛，浸潤性更高，造成手術切除腫瘤困難，瘤體能夠分泌更多的免疫抑制及免疫逃避因子。

結果提示，腦膠質瘤患者機體存在DC細胞亞群數量下降，從而影響病程。至于DC1、DC2下降的原因可能因腦內存在DC或DC的前體細胞但含量很少，而在荷瘤宿主中腫瘤細胞還釋放一些免疫抑制因子，諸如血管內皮生長因子、白細胞介素10等可使DC凋亡或使其表面的分子表達發生變化，主要組織相容性復合體-Ⅱ類分子表達低，降低某些共刺激分子CD80、CD86等的表達，進而導致DC的功能缺陷使其無法有效遞呈腫瘤抗原，不能激活T細胞以識別和殺傷[6-7]。近年來，DC應用于膠質瘤疫苗的研究報道較多，雖然取得了較大進展，但目前仍然處于動物實驗及臨床前期階段[8-9]。大量研究表明，依據DC的生物學特性，可望制備相應的DC疫苗，根據患者在圍手術期不同時間的免疫功能的變化及免疫功能與膠質瘤惡性程度的關系，為腦膠質瘤的生物免疫防治提供一定的理論依據。

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貴州省科學技術基金資助項目[黔科合J字(2008)2201號]。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.034

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1672-9455(2015)08-1112-02

2014-10-10

2014-11-20)