艱難梭菌感染實驗室檢測技術及其研究進展

龍海燕,楊菁玉 綜述，馮 萍 審校(四川大學華西醫院感染性疾病中心，成都 610041)

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·綜 述·

艱難梭菌感染實驗室檢測技術及其研究進展

龍海燕,楊菁玉 綜述，馮 萍△審校(四川大學華西醫院感染性疾病中心，成都 610041)

艱難梭菌； 細菌培養； 毒素檢測； 免疫學； 分子生物學

艱難梭菌(CD)是一種專性厭氧的革蘭染色陽性芽孢桿菌，它廣泛分布于自然環境、動物和人的糞便中，芽孢抵抗力較強，可在外界環境存活數周至數月。CD本身沒有侵襲性，部分產毒細菌通過分泌毒素A、毒素B及二元毒素引起抗菌藥物相關性腹瀉、結腸炎甚至致死性假膜性腸炎，統稱為艱難梭菌感染(CDI)。廣譜抗菌藥物的使用、炎性反應腸病、慢性肝病、器官移植、化療、長期使用激素、丙種球蛋白減少等患者以及懷孕及分娩前后的婦女更易發生CDI[1]。目前，CD是公認的院內感染和抗菌藥物相關性腹瀉最重要的病因。進入21世紀以來，CDI發病率和疾病嚴重程度在全球范圍內呈上升趨勢。而我國多數醫院對CDI檢查手段有限，診斷率低，因此,目前對早期、快速、準確、廉價地診斷CDI提出了更高要求，以期早期治療，降低住院時間、病死率等。本文就現有CDI檢測技術及其進展作一綜述。

1 CD毒素檢測

1.1 細胞毒性試驗(CTA) CTA是通過驗證標本中存在特異性毒性效應產物來診斷CDI，主要原理是將過濾的糞便抽提物接種至處于生長的健康單層細胞中培養24～48 h，若樣本中存在CD毒素則會出現特殊的細胞病變效應(細胞變圓)，為明確其特異性需再在樣本中加入特定的抗毒素進行細胞毒素中和試驗。研究發現，毒素B所致的細胞病變效力是毒素A的103～104倍[2]。CTA因其敏感性和特異性高曾被美國食品藥品監督管理局認定為檢測CDI的金標準。但是CTA需要難度較高細胞培養技術，測定時間長，受標本稀釋濃度等影響使其在常規臨床微生物實驗室應用有一定困難。

1.2 A/B毒素的免疫學檢測(A/B EIA) 該方法是通過檢測CD產生的主要毒素來判斷CDI。CD通常產生A、B兩種毒素，以前免疫學常針對的是毒素A，但近年國內外均有A/B+株報道，且該菌株仍可導致嚴重CDI[3]。因此，現在都同時檢測A、B兩種毒素以提高檢測的靈敏度。目前主要采用酶聯免疫法、免疫層析法等。其基本原理是通過抗原抗體反應使酶標抗體(或抗原)結合到載體上，經洗滌或層析后與底物反應顯色，根據顏色深淺進行定性或定量分析，數小時即可得出結果，是一種快速、簡單、便宜、設備技術要求不高的檢測手段，目前已經有大量的商品試劑盒上市。以前A/B EIA是應用最為廣泛的診斷方法。但有研究表明，與產毒株培養相比其敏感性為32.8%～57.1%，而且在臨床中標本留取到正式進入檢測的時間如果較長，則毒素容易分解，易造成假陰性[4]。目前普遍認為EIA不能被作為一個單獨診斷CDI的檢查方法。CD毒素是導致CDI最直接的原因，因此毒素檢測對于CDI診斷具有很高特異性，但是其敏感性仍值得商榷。曾有報道，1例經腸鏡檢查診斷為偽膜性腸炎的患者攜帶有CD產毒株，但是卻未檢測到CD毒素，在一定程度上提示若只依靠毒素檢測可能會導致某些CDI的漏診[5]。而關于毒素陽性與疾病嚴重程度的關系也存在一定分歧，這可能是由檢測方法不同導致[6-8]。英國衛生部所發布的指南指出，只有檢測出CD毒素的患者才能上報CDI，因此毒素檢測在臨床上仍占有重要的位置。

2 CD細菌學檢測

2.1 細菌培養 這是CDI的傳統檢測方法，其主要步驟是預處理大便后，接種至CD選擇性培養基-環絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂(CCFA)中，厭氧環境下至少培養48 h。如果有著足夠相關經驗，根據培養基上菌落形態及革蘭染色陽性的證實就可明確有無CD，可疑者可進行進一步的生化鑒定。目前在傳統的培養方法上也有一定的改進，如在CCFA中加入牛磺膽酸鈉或者溶菌酶更有助于芽孢的富集，從而提高了敏感性[9]。CD培養敏感性高，培養得到的細菌可以進一步進行毒素分析、細菌分型、耐藥分析等，有利于流行病學調查研究。但是厭氧菌標本收集要求高，培養難度大，陽性率受操作人員經驗影響大，所需時間長，檢驗成本較高，在臨床實驗室未常規開展，主要用于科研方面。若培養為細菌陽性者也不能區別其是否產毒，因此，限制其進一步的應用。

2.2 CD共同抗原(GDH)檢測 CD共同抗原是CD表面大量表達的谷氨酸脫氫酶，目前主要用免疫學方法直接檢測大便中的GDH抗原。Crobach等[10]研究發現，GDH檢測與細菌培養和產毒株培養比較，其平均敏感性分別為88%和60%。Shetty等[11]用Meta分析發現，GDH檢測的陰性預測值在94.6%～100%。GDH穩定性和靈敏度較高，不易受到標本存放時間的影響，但不能區分是否為產毒株，且其最大優勢在于有很高的陰性預測值，陰性結果者即可基本排除CD的存在，陽性者可再進一步行毒素或產毒基因檢測，因此可以作為二步法或三步法的篩查試驗。

3 CD產毒菌株檢測

3.1 產毒菌株培養(TC) TC包括CD培養和毒素檢測兩個步驟。CD培養陽性者再進行毒素檢測，后者主要有細胞毒性檢測，聚合酶鏈反應(PCR)檢測毒性基因，免疫法檢測毒素A/B等。聚合酶鏈反應(PCR)只是檢測毒素基因，其有不一定表達或表達量太少無法致病的可能，而A/B EIA敏感性不高，因此目前產毒菌株培養是指CD培養加細胞毒性檢測才是公認的診斷CDI的金標準[12[13-14]。

3.2 核酸擴增試驗(NAAT)

3.2.1 PCR 因為所有產毒菌株都攜帶B毒素基因，因此大部分PCR主要針對艱難梭菌B毒素基因tcdB，也有針對艱難梭菌A毒素基因tcdA，負向調節基因tcdC，編碼二元毒素的基因cdtA和cdtB，CD的特異性基因等。在普通PCR基礎上已經發展出實時熒光PCR，多重PCR等技術應用于CDI檢測。Deshpande等[15]用Meta分析發現，實時熒光PCR與TC和CTA相比，其平均敏感性和特異性分別為90%、96%、89%、97%。Persson等[16]使用多重PCR檢測tcdA、tcdB、ctdA、cdtB和tcdC，發現其對027核酸型有很高特異性，并且能檢測其他CD臨床類型，對流行病學也有重要意義。目前已經有多種商品試劑盒上市，有些可直接用于糞便檢測，耗時1～5 h不等，因其快速、高敏感性而被廣泛認可。但是PCR仍存在一些問題：如引物結合區基因修飾導致假陰性結果；只攜帶產毒基因卻不表達或少量表達而不足以致病；無法區分疾病嚴重程度；新型菌株出現時易漏診，檢測費用昂貴等。

3.2.2 環介導等溫擴增技術(LAMP) 因LAMP對目標基因長度只能控制在200 bp左右，因此其針對的是tcdA。LAMP是利用鏈置換反應在一定溫度下進行，反應只需將基因模板、4種針對靶基因的6個區域的特異性引物、鏈置換型DNA合成酶、基質等共同置于一定溫度(60～65 ℃)下，經1個步驟即可完成。Lalande等[17]以產毒株培養為金標準，用LAMP檢測CD發現,敏感性和特異性分別可達91.8%和99.1%且可1 h內出結果。Boyanton等[18]用實時熒光PCR與LAMP相比發現兩者在敏感性上相差無幾，后者特異性稍低一些，但都遠遠超過A/B EIA。該方法檢測時間短(1 h左右)、設備簡單、操作簡便、費用相對便宜，配合相應顯色試劑還能實現肉眼判別結果。但其缺點是容易污染，造成假陽性結果；有些產毒菌株有tcdA缺失，從一定程度上影響了LAMP準確度。

3.2.3 依賴解螺旋酶恒溫擴增技術(HDA) 該技術是2004年報道的一種新型恒溫基因擴增技術。HDA基本原理是先用解旋酶解開雙鏈DNA，再依靠單鏈DNA結合蛋白與模板單鏈結合，使模板單鏈處于單鏈狀態并保護它的完整性，引物與模板雜交，然后在DNA聚合酶催化下擴增，新合成的雙鏈DNA即產物作為底物進入下一輪擴增。目前有分別針對tcdA、tcdB的HDA。Deak等[19]發現AmpliVue C.Difficile assay(針對tcdA)與LAMP法比較，其敏感性和特異性分別為96%、100%。有學者對The Portrait Toxigenic C.difficile assay(針對tcdB)進行了一個多中心的臨床檢測評價，發現該法以TC為金標準，其敏感性和特異性分別為98.2%、92.8%，可在90 min內出結果[20]。HDA模仿自然界DNA合成方式，不易引起非特異性擴增，具有高敏感性和高保真性。反應在同一溫度下可以進行，因而不需要昂貴的PCR儀，很適合基層實驗室的使用，為一種嶄新的恒溫擴增技術，雖然還有待更進一步的探索研究，但是具有很大的發展前景。

目前NAAT因其敏感性高、快速而被廣泛認可，2013年《美國胃腸病學雜志》發表的關于CDI診斷的指南中指出，建議NAAT可以單獨作為一種診斷手段[1]。它有利于臨床CDI診治和控制措施的快速開展，從而減少經驗性治療、平均住院時間、CD傳播的發生率等，因此可一定程度上降低整體醫療支出[21]。但在臨床應用中仍發現一些問題：難以區分無癥狀攜帶者；導致CDI發病率報道的增加[22]。因此，建議臨床醫生把檢測手段與臨床癥狀相結合以綜合判斷病情。

4 二步法和三步法

CTA和TC因敏感性高而曾先后推薦為CDI的診斷金標準，但其技術要求高，耗費時間長；A/B EIA雖然方便、快速、便宜但敏感性不足；NAAT敏感性高、快速，但費用昂貴。因此很多指南推薦二步法和三步法，但關于該法的具體構成存在不一致性。2012年英國衛生部更新的指南建議：使用NAAT或GDH為初篩試驗，陽性者再加敏感的A/B EIA，全陽性考慮CDI；NAAT(GDH)陽性，A/B EIA陰性，考慮CD攜帶，有傳染的可能性，可選擇性地再進行PCR檢測；全陰性不考慮CDI。2013年美國《胃腸病學雜志》發表的指南建議，GDH為初篩試驗，陰性者排除CDI；陽性者必須再進行NAAT或A/B EIA檢測；NAAT陽性則考慮CDI，反之排除；A/B EIA陽性者考慮CDI，陰性者還需再用NAAT進行確診[2]。無論二步法或三步法構造怎樣，其都具有很好的敏感性和特異性[23-24]；雖然確診可能會稍有延長，但能夠迅速排除CDI，明顯縮減疾病負擔費用[25]。見表1。

表1 CDI實驗室檢測技術比較

5 小 結

CD正在不斷進化，CDI的地理范圍、嚴重程度、發病特點、人群種類也在不斷變化。診斷CDI的檢測技術也經歷了產毒細菌分離培養，免疫學檢測到分子生物學技術檢測時代。細菌分離培養是金標準，但對標本、技術人員要求高，耗時長；免疫學檢測快速但是敏感性較低；NAAT則以更敏感、更快速而被大家推崇，雖然費用稍高，但是隨著不同的NAAT技術發展，費用正在逐步降低，有望走向臨床；二步法和三步法同時具有很好的敏感性和特異性，可針對性檢測，從而在整體效益上明顯縮減醫療費用，也有臨床應用前景。但是因檢測到CD產毒基因并不代表CDI，因此CDI診斷需要結合患者癥狀和其他生化輔助指標以綜合評判患者的病情，以免過度治療。如何提高CDI診斷率仍將是生物學工作者及臨床醫生的一大難題，本綜述對CDI的診斷技術進行復習，希望對提高CDI的診斷意識及水平有一些幫助。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.049

A

1672-9455(2015)08-1143-03

2014-10-17

2014-11-22)

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