國產和進口熒光定量PCR試劑檢測HBV-DNA的比對分析*

張 玥，田文君，劉義慶，張炳昌，張 慶，渠 滕，劉春梅

(山東大學附屬省立醫院檢驗科，濟南 250021)

?

·論 著·

國產和進口熒光定量PCR試劑檢測HBV-DNA的比對分析*

張 玥，田文君，劉義慶，張炳昌，張 慶，渠 滕，劉春梅△

(山東大學附屬省立醫院檢驗科，濟南 250021)

目的 分析國產和進口實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑檢測乙型肝炎病毒(HBV)-DNA的相關性，探討國產和進口試劑在臨床應用中的差異。方法 使用國產和進口試劑平行檢測262例乙型肝炎(乙肝)患者血漿當中的HBV-DNA水平，國產試劑采用手工提取標本，羅氏LightCycler480 Ⅱ(LC480 Ⅱ)進行核酸擴增；進口試劑則采用羅氏COBAS AmpliPrep(CAP)和COBAS Taqman48(CTM)進行標本提取和擴增；對HBV-DNA病毒載量數據進行對數轉換(log10)，并將兩組數據進行相關分析。結果 國產和進口試劑檢測結果，經線性擬合，R2=0.814 3。HBV-DNA濃度在10～103IU/mL的標本，R2=0.300 6；濃度在104～105IU/mL的標本，R2=0.411 8；濃度在106～108IU/mL的標本，R2=0.801 7。進口試劑陽性檢出率為75.57%(198/262)，明顯高于國產試劑陽性檢出率[65.65%(172/262)]。結論 國產試劑和進口試劑相比，相關性良好。HBV-DNA濃度在106～108IU/mL時，相關性最高；濃度在104～105IU/mL時，相關性一般；濃度在10～103IU/mL時相關性較差，國產試劑與進口試劑有明顯差異，靈敏度有待進一步提高。

乙型肝炎病毒DNA； 實時熒光定量PCR； 試劑比對； 血漿

乙型肝炎(簡稱乙肝)是世界常見的傳染病之一[1]，全球感染乙肝的人群約有3.5億[2]，中國大約1.2億人，占三分之一[3]，占我國人口總數的8%～10%，是感染乙型肝炎病毒(HBV)人數最多的國家。HBV是屬于嗜肝DNA病毒科，有較強的抵抗性、傳染性和變異性，并且傳播途徑多樣。乙肝極易發展為慢性肝炎和肝硬化，從而引發肝癌[3]，所以預防和治療乙肝已成為中國乃至全球尤為重要的研究課題之一。現今，在臨床眾多檢測HBV感染的方法中，實時熒光定量PCR技術檢測乙肝病毒核酸(HBV-DNA)是目前特異性較好、靈敏度較高的方法[4]，HBV-DNA復制越高，傳染性就越強。同時，結合乙肝五項[5]、肝功能和甲胎蛋白(AFP)等項目的測定，可以更好地反映出乙肝患者的病情和用藥治療情況，從而為臨床醫生對患者進行診斷和治療提供可靠的理論依據。本文就收集的262例乙肝患者血液標本，采用兩種不同的試劑進行檢測并統計分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年7月至2014年1月的期間在本院就診做超敏乙肝病毒DNA(HS-HBV-DNA)檢測時的乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血標本262例。將標本按3 000 r/min離心8 min，留取血漿冷凍于-80 ℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑 試劑A由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供；試劑B由羅氏診斷產品有限公司提供。試劑A、B分別用羅氏LC480 Ⅱ擴增儀和羅氏CAPCTM檢測系統，實驗所用試劑在有效期內，儀器均已進行校準。

1.3 方法 將262例血漿標本分別用試劑A、B進行平行檢測，試劑A采用人工提取核酸和實時熒光定量檢測技術，最低檢出限為5×102IU/mL，定量檢測線性范圍為(1×103)～(5×107)IU/mL；試劑B基于羅氏CAP提取儀標本制備過程和同時進行的靶DNA PCR擴增與靶序列特異性雙標記寡核苷探針檢測過程，最低檢出限為12×10 IU/mL，定量檢測線性范圍為(5.45×10)～(1×108)IU/mL。

1.3.1 試劑A 離心管中加人100 μL待測血漿標本和100 μL的DNA提取液1，充分振蕩混勻，13 000 r/min離心10 min；吸棄上清液；加入25 μL DNA提取液2，振蕩混勻，完全將沉淀溶解，3 000 r/min離心10 s，然后100 ℃干浴10 min；13 000 r/min離心10 min，離心完畢后，取2 μL上清液加入PCR管內的反應液中。

1.3.2 試劑B 取待測血漿標本1 030 μL，加入帶條碼夾的樣品管中，與配套專用試劑盒裝入羅氏CAP提取儀內。

1.3.3 質量控制 試劑A每批次做陰性對照、空白對照及高中低三個不同水平的質控品；試劑B每批次均做陰性對照及一個低水平的質控品。

1.4 統計學處理 首先對HBV-DNA病毒載量數據進行對數轉換(log10)，采用SPSS21.0軟件進行統計學分析。試劑比對用線性分析和χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩種試劑檢測結果相關分析 將試劑A、B的檢測結果取對數值后做相關分析，通過分析曲線可以看出，線性良好，試劑A、B契合度一般，R2=0.814 3，線性曲線如表1所示。

表1 兩種試劑檢測結果相關分析

2.2 兩種試劑檢測率比較 試劑B陽性檢出率為75.57%(198/262)，試劑A陽性檢出率為65.65%(172/262)，經檢驗，進口試劑陽性檢出率明顯高于國產試劑(χ2=20.833，P<0.01)，結果詳見表2。

表2 兩種試劑檢測率比較(n)

3 討 論

HBV-DNA定量可以精準地反映患者體內的病毒復制情況，目前檢測HBV-DNA定量的方法和試劑種類繁多，國際公認進口羅氏試劑為檢測HBV-DNA定量的參比試劑[6]。進口試劑靈敏度高、精密度好，但試劑成本較高，儀器價格昂貴，檢測時間長，需要患者血漿量大，在大部分醫院難以廣泛使用。國產試劑基本為開放試劑，價格適中，檢測快速，重復性較好，醫院因為科室發展和經濟水平等原因，使用國產試劑的單位比較普遍[7]。試劑A為煮沸法，手工提取核酸繁瑣復雜，極易造成核酸的丟失，容易將檢出限附近的低濃度標本漏檢[8]；試劑B采用磁珠分離技術，標本處理在羅氏CPA提取儀內進行，降低了因操作不當等原因產生的假陽性，且每個標本中加入內標來防止假陰性，監測整個提取和擴增過程，試劑前期準備也簡單、便捷。

本組結果分析可以看出，兩種試劑線性相關性良好，R2=0.814 3。HBV-DNA濃度在106～108IU/mL時，相關性最高；濃度在104～105IU/mL時，相關性一般；濃度在10～103IU/mL時相關性較差，較進口試劑差異有統計學意義，靈敏度有待進一步提高。在262例標本檢測結果中，有28例經試劑A檢測陰性而試劑B檢測陽性，提示試劑B的靈敏度更高；有2例標本，試劑A檢測陽性而試劑B檢測陰性，說明在用試劑A提取過程存在污染的可能。兩種試劑提取方法和對標本體積的需求量不同，所以試劑的靈敏度、精密度和操作過程等也不同。在262例標本當中，其中4例標本濃度大于5×107IU/mL，用羅氏CAPCTM檢測系統第一次上機實驗未得出數據，經10倍稀釋得出結果。用試劑A做4例標本，不用稀釋便可得出實驗結果。使用試劑B做濃度大于5×107IU/mL的標本時，必須稀釋。所以，在乙肝活動期或明確高濃度標本時，可以直接選擇試劑A來檢測HBV-DNA水平。

現在臨床治療乙肝以核苷類抗病毒藥物為主，在長期的治療過程當中，極易發生HBV的變異和耐藥[9]。HBV變異和耐藥的發生，不僅使患者治療費用增加，如不及時發現，甚至會進一步惡化，使病情加重，影響后續治療藥物的選擇。實時、準確地監測乙肝患者HBV-DNA的水平，不僅是臨床醫生用藥的關鍵性指標，也是患者了解病情的直觀數據[10]。雖然進口試劑價格較貴，但是靈敏度相比較高，可以在用藥治療后，進行隨訪檢測，觀察是否到達預期治療效果。國產試劑在中、高濃度范圍內，相關性良好，患者在初診、乙肝活動期或HBV反跳時進行檢測，不僅減少了患者看病時間和經濟負擔，還可以提高患者和醫生對臨床實驗室的滿意度。

綜上所述，2種實時熒光定量PCR檢測試劑，標本HBV-DNA濃度在10～103IU/mL時，國產試劑與進口試劑差異有統計學意義。進口試劑靈敏度較高，適用于乙肝患者耐藥后選擇新藥治療的療效評估和患者治療后期的病情監測。乙肝活動期或做高濃度標本時，可以直接選擇試劑A。臨床醫生可根據患者的具體病情，選擇適合的檢測試劑。

[1]朱妍.137例病毒性肝炎的病原學分析[J].中國醫藥指南，2013，11(9)：612-613.

[2]Tankivanich P，Sa-Nguanmoo P，Mahachai V，et al.A case-control study on sequence variations in the enhancer Ⅱ /core promoter /precore and X gens of hepatitis B virus in patients with hepatocellular carcinoma[J].Hepatol Int，2010，4(3)：577-584.

[3]吳肖峰.PreS1Ag與HBV-DNA、乙肝病毒“兩對半”的相關性分析[J].中國當代醫藥，2011，18(14)：81-82.

[4]Caliendo AM，Valsamakis A，Bremer JW，et al.Multi-laboratory evaluation of real-time PCR tests for hepatitis B virus DNA quantification [J].J Clin Microbiol,2011,49(8):2854-2858.

[5]韓曉蓉.乙肝五項指標測定結果與HBV DNA的關系探析[J].中外醫療，2012，32(17)：40-42.

[6]Allice T，Cerutti F，Pittaluga F，et al．Comparison of the Cobas Ampliprep/Cobas TaqMan HBV Test versus the Cobas Amplicor HBV monitor for HBV-DNA detection and quantification during antiviral therapy[J]．New Micmbiol，2008，31(1)：27-35．

[7]荊成寶，禹梅，劉婕.2種HBV-DNA熒光定量PCR檢測試劑的比較[J].國際檢驗醫學雜志，2013，34(2)：206-207.

[8]陳小穎，趙榮平，應春妹.實時熒光定量PCR檢測低含量HBV-DNA的分析[J].現代檢驗醫學雜志，2009，24(5)：85-87.

[9]Ghany MG，Doo EC．Antiviral resistance and hepatitis B therapy [J]．Hepatology，2009，49(5 Suppl)：S174-S184.

[10]蔡惠興，吳英，梁鵬.乙肝血清標志物與HBV-DNA定量檢測結果分析 [J].國際醫藥衛生導報，2010,16(2)：227-229.

Comparative analysis on domestic and imported fluorescent quantitative PCR reagents for detecting HBV-DNA*

ZHANGYue,TIANWen-jun,LIUYi-qing,ZHANGBing-chang，ZHANGQing,QUTeng,LIUChun-mei△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedShandongProvincialHospital,ShandongUniversity,Jinan,Shandong250021,China)

Objective To analyze the correlation between the domestic and imported real-time fluorescent quantitative PCR reagents for detecting HBV-DNA and to explore their difference in clinical application.Methods The domestic and imported reagents were used to parallelly detect the plasma HBV-DNA content in 262 cases of hepatitis B.The domestic reagent adopted the sample extracting by adopting the manual method and the amplification for nucleic acid was performed by the Roche LightCycler480 Ⅱ(LC480 Ⅱ);the imported reagent used the Roche COBAS AmpliPrep (CAP) and COBAS Taqman48(CTM) for conducting the sample extracting and amplification;the HBV DNA viral load data (log10) was performed the logarithmic transformation and the 2 sets of data were conducted the correlation analysis.Results The detection results of the domestic and imported reagents were performed the linear fitting,R2=0.814 3.The sample with the concentration range of 10-103IU/mL,R2= 0.300 6;the sample with the concentration range of 104-105IU/mL,R2= 0.411 8;the sample with the concentration range of 106-108IU/mL,R2=0.801 7.The positive detection rate of the imported reagent was 75.57% (198/262),which was significantly higher than 65.65% (172/262) of the domestic reagent.Conclusion There is a good correlation between the domestic reagent and imported reagent.The correlation is the highest when the HBV-DNA concentration in the range of 106-108IU/mL;the correlation is general when the concentration in the range of 104-105IU/mL;the correlation is lowest when the concentration in the range of 10-103IU/mL,there is a significant difference between the domestic reagent and imported reagent and the sensitivity of the domestic reagent remains to be further improved.

HBV-DNA; real-time fluorescent quantitation PCR; reagent comparison; plasma

國家自然科學基金資助項目(81102220)；山東省自然科學基金資助項目(ZR2011HM019)； 山東省臨床重點專科建設項目(魯衛醫字[2013]26號)。

張玥，女，技師，本科，主要從事肝病的分子診斷工作。△

，E-mail：lcm831011@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.002

A

1672-9455(2015)02-0147-02

2014-05-07

2014-08-28)